背景[1-3]
芽孢桿菌顯色培養(yǎng)基可以從食品、臨床和非臨床樣本的混合菌群中，通過菌落顯色，分離和區(qū)分不同芽孢桿菌物種。
大部分芽孢桿菌對(duì)人和動(dòng)物無害，只有炭疽芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌是例外?？莶菅挎邨U菌被認(rèn)為與潛在的食物中毒有關(guān)(1)。蠟樣芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)可使大米、淀粉類食物如土豆、奶酪等污染而導(dǎo)致食物中毒（3,4,5）、眼部感染和許多其他臨床疾病，如膿腫形成、腦膜炎、敗血癥、傷口感染。許多芽孢桿菌還是食物腐敗菌。
培養(yǎng)基包括氮源營(yíng)養(yǎng)。甘露醇提供發(fā)酵用碳水化合物，可被酚紅檢測(cè)到。巨大芽孢桿菌作為發(fā)酵菌，產(chǎn)生黃色菌落。培養(yǎng)基中的顯色混合物被蠟樣芽孢桿菌的beta-葡糖苷酶裂解，導(dǎo)致藍(lán)色菌落形成。蘇云金芽孢桿菌呈藍(lán)綠色。但蠟樣桿菌菌落扁平，有藍(lán)色中心；而蘇云金桿菌邊緣則為不規(guī)則。
使用方法：49.22g干粉溶1000ml蒸餾水加熱煮沸使培養(yǎng)基完全溶化，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至45-50℃。對(duì)于選擇性分離蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌，無菌加入1管復(fù)溶的芽孢桿菌選擇性添加劑，混勻并傾注于無菌平皿中。
芽孢桿菌顯色培養(yǎng)基
操作步驟：
1、按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、SN標(biāo)準(zhǔn)、FDA標(biāo)準(zhǔn)或其它方法制備樣品液
2、樣品液在30±1℃增菌培養(yǎng)18-24小時(shí)；
3、取增菌液劃線接種于蠟樣芽孢桿菌顯色培養(yǎng)基平板上，30±1℃培養(yǎng)18～24h。蠟樣芽孢桿菌典型菌落為藍(lán)綠色且菌落比較大。若24小時(shí)沒有出現(xiàn)典型菌落，可延長(zhǎng)培養(yǎng)至48小時(shí)。
4、對(duì)可疑蠟樣芽孢桿菌可劃線接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，30±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑取單菌落做蠟樣芽孢桿菌全套生化試驗(yàn)。
應(yīng)用[4][5]
用于蘇云金芽孢桿菌中抗生素Zwittermicin A的分離純化與檢測(cè)研究
圍繞蘇云金芽孢桿菌HD-1中Zwittermicin A的分離純化與檢測(cè)方法的建立進(jìn)行初步研究。首先,對(duì)蘇云金芽孢桿菌HD-1擴(kuò)大生產(chǎn)的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究,優(yōu)化了發(fā)酵條件和Zwittermicin A粗提液制備流程,為Zwittermicin A的分離純化奠定了基礎(chǔ)。
發(fā)酵條件為：采用氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng),選擇大豆分離蛋白培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度為30℃,發(fā)酵時(shí)間為36h,培養(yǎng)基初始pH為7.5。其次,選用非極性大孔樹脂LX-68M初步純化。
大孔樹脂純化條件為：選擇非極性大孔樹脂LX-68M,靜態(tài)吸附3h,去離子水洗脫6BV,收集后減壓濃縮,回收率為87%。再次,用硅膠柱層析進(jìn)行二次純化,根據(jù)ZwittermicinA與茚三酮的顯色反應(yīng),以及草生歐文氏桿菌對(duì)其敏感等特點(diǎn),進(jìn)行活性物質(zhì)的跟蹤監(jiān)測(cè)并收集。
硅膠柱層析純化條件：選擇100～140目硅膠,濕法裝柱,干法上樣,柱床高度為40cm,上樣體積為5mL,洗脫劑為乙酸乙酯：甲醇=70：30（V／V）,流速0.5mL/min。最后,對(duì)純化后樣品用分析型HPLC-MS進(jìn)行純度分析,ESI-MS進(jìn)行分子量鑒定,最后得到純度為89%的Zwittermicin A精制品約90mg（1L發(fā)酵液）。
從而建立了一種效能高,成本低,可重復(fù)性強(qiáng)的Zwittermicin A精制品回收工藝,為Zwittermicin A標(biāo)準(zhǔn)品的半制備提供了前提條件。本研究建立了3種ZwA含量的檢測(cè)方法。首先是相對(duì)含量檢測(cè)法,ZwA含量與抑菌圈的直徑存在良好的線性關(guān)系,根據(jù)抑菌圈直徑大小來計(jì)算ZwA相對(duì)含量。
其次是HPLC檢測(cè)方法,色譜條件為反相C18分析柱,流動(dòng)相為水：甲醇=85：15（V/V）,紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm,流速為0.5mL/min,進(jìn)樣量10μL,柱溫35℃,保留時(shí)間為10.0～10.5min,檢測(cè)出Zwittermicin A精制品的純度為89%。
最后是以腐胺為標(biāo)準(zhǔn)品,建立了茚三酮顯色法測(cè)Zwittermicin A含量。其中,HPLC檢測(cè)條件的建立為Zwittermicin A的HPLC半制備奠定了基礎(chǔ),以腐胺為標(biāo)準(zhǔn)品的茚三酮顯色法測(cè),也解決了由于沒有標(biāo)準(zhǔn)品而無法定量測(cè)定Zwittermicin A含量的障礙,為今后關(guān)于Zwittermicin A純化的進(jìn)一步研究以及其作為增效因子在生物防治中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。