背景[1-3]
蛋白激酶A(抗體)是一類可以特異性結合蛋白激酶A的多克隆抗體。主要用于體外檢測蛋白激酶A的免疫學實驗。
蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）又稱依賴于cAMP的蛋白激酶A（cyclic-AMP dependent protein kinase A），是一種結構最簡單、生化特性最清楚的蛋白激酶。
PKA全酶分子是由四個亞基組成的四聚體，其中兩個是調節(jié)亞基（regulatory subunit，簡稱R亞基），另兩個是催化亞基（catalytic subunit，簡稱C亞基）。R亞基的相對分子質量為49～55kDa，C亞基的相對分子質量為40kDa，總相對分子質量約為180kDa；全酶沒有活性。在大多數哺乳類細胞中，至少有兩類蛋白激酶A，一類存在于胞質溶膠，另一類結合在質膜、核膜和微管上。
蛋白激酶A
PKA全酶以四聚體形式存在，但PKA被靶向到特定組分時，也會在細胞中形成更高階的結構。經典的PKA全酶結構由兩個調節(jié)亞基（R亞基）和兩個催化亞基（C亞基）組成。催化亞基包含活性位點、在結合和水解ATP的蛋白激酶中發(fā)現的一系列典型殘基以及結合調節(jié)亞基的結構域。調節(jié)亞基具有結合到cAMP的結構域，該結構域與催化亞基和自身抑制結構域相互作用。調節(jié)亞基有兩種主要形式：RI和RII。
蛋白激酶A是一組結構多樣的蛋白質，具有與蛋白激酶A（pka）的調節(jié)亞單位結合和將全酶限制在細胞內離散位置的共同功能。AKAP6是AKAP家族的成員。在不同的腦區(qū)、心臟和骨骼肌中高度表達。特異性定位于肌漿網和核膜，參與將pka錨定到核膜或肌漿網。
應用[4][5]
用于蛋白激酶A（PKA）在血小板凋亡中的作用研究
探究蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）在血小板凋亡中所發(fā)揮的作用。
方法：采集健康志愿者空腹靜脈全血,分離得到洗滌血小板及富含血小板血漿（Platelet rich plasma,PRP）,調整血小板的濃度至3×108/ml。人的洗滌血小板與不同濃度的PKA抑制劑H89或對照二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）于22℃孵育160min,利用Western blot檢測血小板PKA底物GPIbβ（Ser166）的磷酸化程度,用電子顯微鏡觀察血小板的形態(tài)改變。
人的洗滌血小板與H89（37.5μM）或對照DMSO于22℃孵育不同的時間,使用流式細胞儀檢測血小板線粒體跨膜電位（Mitochondrial inner transmembrane potential,ΔΨm）變化和磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）外翻程度。
洗滌血小板與不同濃度的PKA激活劑Forskolin或陰性對照（DMSO）在室溫下孵育10min,然后用ABT737（1μM）在37℃條件下處理90min,利用流式細胞儀檢測血小板ΔΨm和PS外翻的變化。
采集6-8周三種PKA(PKA+/+、PKA+/-、PKA-/-)基因型小鼠下腔靜脈全血,分別檢測血小板的數量,PKA蛋白的表達情況和PKA底物GPIbβ的磷酸化程度,并且檢測血小板ΔΨm去極化程度。
給野生型ICR小鼠注射PKA的抑制劑Rp-c AMPS,之后使用血細胞計數儀檢測小鼠體內血小板數量。從糖尿病患者和正常人全血中分別分離血小板和富含血小板血漿（Platelet rich plasma,PRP）,使用Western blot檢測血小板中PKA底物GPIbβ的磷酸化程度,用ELISA法檢測血小板中PKA的活性,并利用流式細胞儀檢測血小板ΔΨm和PS外翻的變化。
利用ELISA法檢測糖尿病患者和正常人血漿中凝血酶產生的情況。在體外分別用Forskolin和不同濃度的凝血酶處理血小板,利用流式細胞儀檢測血小板ΔΨm和PS外翻的變化。
參考文獻
[1]The regulation of Sema4D exodomain shedding by protein kinase A in platelets[J].Chen,Xu,Li,Mou,Zeng,Brass,Zhu.Platelets.2016(7)
[2]Platelet transactivation by monocytes promotes thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.[J].Tutwiler Valerie,Madeeva Daria,Ahn Hyun Sook,Andrianova Izabella,Hayes Vincent,Zheng X Long,Cines Douglas B,McKenzie Steven E,Poncz Mortimer,Rauova Lubica.Blood.2016(4)
[3]Roflumilast inhibits leukocyte–platelet interactions and prevents the prothrombotic functions of polymorphonuclear leukocytes and monocytes[J].L.Totani,C.Amore,A.Di Santo,G.Dell’Elba,A.Piccoli,N.Martelli,H.Tenor,R.Beume,V.Evangelista.J Thromb Haemost.2016(1)
[4]Thrombin-induced reactive oxygen species generation in platelets:A novel role for protease-activated receptor 4 and GPIbα[J].Naadiya Carrim,Jane F.Arthur,Justin R.Hamilton,Elizabeth E.Gardiner,Robert K.Andrews,Niamh Moran,Michael C.Berndt,Pat Metharom.Redox Biology.2015
[5]李孝東.蛋白激酶A（PKA）在血小板凋亡中的作用[D].蘇州大學,2018.