背景^[1-3]

人凋亡抑制因子4 ELISA KIT可以用于體外檢測(cè)人凋亡抑制因子4在樣本中的含量。

原理：用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗該指標(biāo)抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗該指標(biāo)抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成的黃色。顏色的深淺和樣品中的該指標(biāo)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

人凋亡抑制因子4

操作步驟：

1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液）100μl，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

應(yīng)用^[4][5]

用于程序性細(xì)胞死亡4增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性及機(jī)制研究

TRAIL可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞的凋亡,并且發(fā)現(xiàn)了一些可調(diào)控TRAIL敏感性的因子如端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、DNMT1基因及阿司匹林。

觀察了PDCD4對(duì)TRAIL敏感性的影響,并對(duì)FLIP和PI3K/Akt途徑在此過(guò)程中的作用進(jìn)行了研究。

方法1.細(xì)胞株和抗體人胃癌細(xì)胞株MKN28、SGC7901、BGC823于含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)?？扇苄灾亟M人TRAIL購(gòu)自ProSpect（以色列）;羊抗人PDCD4、鼠抗人FLIP、鼠抗人caspase-8及活化的caspase-8（cleaved-caspase-8）（p41/43）、鼠抗人Akt及磷酸化Akt（p-Akt）購(gòu)自SantaCruz（美國(guó)）;鼠抗人β-actin、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）包被的羊抗鼠二抗、兔抗羊二抗、羊抗兔二抗購(gòu)自Boister（中國(guó)）。

2.含PDCD4基因質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染pBluescriptR-PDCD4質(zhì)粒（Invitrogen,美國(guó)）經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I雙酶切后獲得PDCD4 cDNA片段。將PDCD4片段亞克隆至真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP（全軍燒傷研究所）,轉(zhuǎn)染至感受態(tài)大腸桿菌DH5α,接種至含30%卡那霉素的LB培養(yǎng)皿中,挑取單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒并經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定獲得含PDCD4基因的質(zhì)粒,命名為pIRES2-PDCD4。利用脂質(zhì)體2000（Invitrogen）轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞BGC823中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)G418篩選3 W,獲得表達(dá)綠色熒光的單個(gè)細(xì)胞克隆,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PDCD4的細(xì)胞系。

參考文獻(xiàn)

[1]c‐FLIP expression in colorectal carcinomas:association with Fas/FasL expression and prognostic implications[J].PKorkolopoulou,A ASaetta,GLevidou,FGigelou,ALazaris,IThymara,MScliri,KBousboukea,N VMichalopoulos,NApostolikas,AKonstantinidou,MTzivras,EPatsouris.Histopathology.2007(2)

[2]TRAIL receptor-targeted therapy[J].Donald J Buchsbaum,Tong Zhou,Albert F LoBuglio.Future Oncol..2006(4)

[3]The E3 Ubiquitin Ligase Itch Couples JNK Activation to TNFα-induced Cell Death by Inducing c-FLIP L Turnover[J].Lufen Chang,Hideaki Kamata,Giovanni Solinas,Jun-Li Luo,Shin Maeda,K.Venuprasad,Yun-Cai Liu,Michael Karin.Cell.2006(3)

[4]Differential expression in normal-adenoma-carcinoma sequence suggestscomplex molecular carcinogenesis in colon[J].Seungkoo Lee,Seunghyun Bang,Kyuyoung Song,Inchul Lee.Oncology Reports.2006(4)

[5]王偉強(qiáng).程序性細(xì)胞死亡4增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性及機(jī)制研究[D].第三軍醫(yī)大學(xué),2009.