背景[1-3]
乳糖發(fā)酵對(duì)照培養(yǎng)基主要用于大腸菌群復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，也可用于大腸桿菌確證試驗(yàn)。
大腸菌群主要包括暢桿菌科中韻埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、魔雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。這些屬的細(xì)菌均來自于人和溫血?jiǎng)游锏哪c道，需氧與兼性厭氧，不形成芽孢；在35～37℃條件下，48小時(shí)內(nèi)能發(fā)酵乳糖聲酸產(chǎn)氣，革蘭氏陰性。大腸菌群中以埃希氏菌屬為主，埃希氏菌屬教俗稱為典型大腸桿菌。
大腸菌群都是直接或間接地來自人和溫血?jiǎng)游锏募S便。本群中典型大腸桿菌以外的菌屬，除直接來自糞便外，也可能來自典型大腸桿菌排出體外7～30天后在環(huán)境中的變異。所以食品中檢出大腸菌群J表示食品受動(dòng)人寢溫血?jiǎng)游锏募S便污染，其中典型大腸桿菌為糞便近期污染，其他菌屬則可能為糞便的陳舊污染。
復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：
1、用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物dao
2、移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯BGLB)管中
3、培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度36℃±1℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h±2 h
4、觀察產(chǎn)氣情況：產(chǎn)氣者,計(jì)為大腸菌群陽性管。
蛋白胨作為基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)提供氮源、氨基酸和其他的生長因子滿足細(xì)菌生長的需求；乳糖提供碳源；溴甲酚紫作為酸堿指示劑，發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)酸，培養(yǎng)基pH下降，溴甲酚紫顯黃色。本培養(yǎng)基無任何抑菌劑，適合于乳糖發(fā)酵試驗(yàn)，配制好的顏色為紫色透明液體。
應(yīng)用[4][5]
用于產(chǎn)乙醇重組大腸桿菌代謝工程改造及乙醇發(fā)酵研究
選取大腸桿菌為主要研究對(duì)象,以獲得優(yōu)良產(chǎn)乙醇菌株為目的,并以此為基礎(chǔ)探索生物質(zhì)乙醇發(fā)酵新工藝與新技術(shù),以期改善生物質(zhì)乙醇的生產(chǎn)效率與經(jīng)濟(jì)可行性。
結(jié)果:1)阻斷大腸桿菌主要有機(jī)酸副產(chǎn)物合成途徑,顯著提高了其代謝葡萄糖合成乙醇的得率。在刪除了甲酸、乙酸和乳酸合成途徑的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了乙醇生產(chǎn)菌Escherichia coli B0013-1030PA;在搖瓶發(fā)酵水平上,此菌株能夠代謝25 g·L-1葡萄糖產(chǎn)生11.25 g·L-1乙醇,乙醇得率為理論得率的86.0%,較對(duì)照提高了15.7%;此菌株在乙醇發(fā)酵的同時(shí),合成并積累2.37 g·L-1琥珀酸,0.18 g·L-1乙酸,乳酸和甲酸未被檢出。
進(jìn)一步刪除其琥珀酸合成途徑關(guān)鍵酶基因frdA,獲得菌株E.coli B0013-1031PA;在搖瓶發(fā)酵水平上,此菌株能夠代謝25 g·L-1葡萄糖產(chǎn)生11.90 g·L-1乙醇,達(dá)到理論得率的93.0%,僅合成與積累0.12 g·L-1琥珀酸。
2) 解析了E.coli B0013利用木糖生長緩慢的遺傳本質(zhì),進(jìn)而通過同源重組修復(fù)了其木糖代謝。以木糖為唯一碳源,E.coli B0013的比生長速率為0.17 h-1,僅為對(duì)照菌株E.coli K12比生長速率(0.35 h-1)的48.6%;在E.coli B0013中表達(dá)E.coli K12木糖運(yùn)輸操縱子xylFGH后,菌株利用木糖的比生長速率恢復(fù)到0.32 h-1;克隆E.coli B0013的xylFGH并進(jìn)行序列測定與分析,xylH的第126位密碼子突變?yōu)榻K止密碼子TAG,引起xylH的讀框提前終止;
通過分子克隆與同源重組,將E.coli K12的xyl H部分片段（117 bp-462 bp）轉(zhuǎn)入E.coli B0013,篩選獲得了xylH回復(fù)突變株E.coli B0013H,其xylH的第126位密碼子由TAG回復(fù)突變?yōu)門GG,此菌株利用木糖的比生長速率為0.33 h-1,接近E.coli K12?？梢?E.coli B0013的xylH發(fā)生無義突變,使其喪失了木糖主要運(yùn)輸功能,木糖代謝變緩;回復(fù)突變xylH后恢復(fù)了其木糖快速利用能力。
參考文獻(xiàn)
[1]Utilization of microalgae feedstock for concomitant production of bioethanol and biodiesel[J].Ramachandran Sivaramakrishnan,Aran Incharoensakdi.Fuel.2018
[2]Co-production of bio-ethanol,xylonic acid and slow-release nitrogen fertilizer from low-cost straw pulping solid residue[J].Chen Huang,Arthur J.Ragauskas,Xinxing Wu,Yang Huang,Xuelian Zhou,Juan He,Caoxing Huang,Chenhuan Lai,Xin Li,Qiang Yong.Bioresource Technology.2018
[3]Cloning and identification of a novel steroid 11α-hydroxylase gene from Absidia coerulea[J].Ruijie Wang,Pengcheng Sui,Xiangjiang Hou,Tong Cao,Longgang Jia,Fuping Lu,Suren Singh,Zhengxiang Wang,Xiaoguang Liu.Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Bio.2017
[4]Simultaneous fermentation of glucose and xylose at elevated temperatures co-produces ethanol and xylitol through overexpression of a xylose-specific transporter in engineered Kluyveromyces marxianus[J].Biao Zhang,Jia Zhang,Dongmei Wang,Ruixiang Han,Rui Ding,Xiaolian Gao,Lianhong Sun,Jiong Hong.Bioresource Technology.2016
[5]孫金鳳.產(chǎn)乙醇重組大腸桿菌代謝工程改造及乙醇發(fā)酵[D].江南大學(xué),2018.