背景[1-3]
兔抗綿羊IGG(H&L)二抗,HRP標(biāo)記是以綿羊IGG(H&L)為抗原以兔為免疫宿主的HRP標(biāo)記免疫蛋白，可以特異性結(jié)合綿羊IGG(H&L)，主要用于檢測(cè)馬IGG的Western blotting、ELISA等生物實(shí)驗(yàn)。第二抗體是能和抗體結(jié)合，即抗體的抗體，其主要作用是檢測(cè)抗體的存在，放大一抗的信號(hào)。二抗是利用抗體是大分子的蛋白質(zhì)具有抗原性的性質(zhì)，去免疫異種動(dòng)物，由異種動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的針對(duì)于此抗體的免疫球蛋白。二抗用于靶抗原的間接檢測(cè)。二抗可通過信號(hào)放大提高靈敏度，并為標(biāo)記和檢測(cè)提供了更大靈活性。
抗體就是平常所說的抗體，即能和抗原特異性結(jié)合。第二抗體是能和抗體結(jié)合的，即抗體的抗體。主要用于檢測(cè)抗體的存在。一抗是針對(duì)抗原的抗體，二抗是針對(duì)一抗的抗體。即抗體也可以充當(dāng)抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。也就是說，抗原進(jìn)入機(jī)體刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，由B細(xì)胞可以產(chǎn)生與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的特殊蛋白質(zhì)。一抗二抗都是一種可以特異結(jié)合別的物質(zhì)的基團(tuán)，而且一抗可以至少結(jié)合兩種其他基團(tuán)（底物和二抗）。
一抗：可以特異結(jié)合底物，就是識(shí)別出我們想要檢測(cè)的東西。一抗和底物結(jié)合與否用肉眼是看不出來的。二抗：可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測(cè)出的標(biāo)記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），作用是檢測(cè)一抗。如果一抗自己帶有可以被檢測(cè)出的標(biāo)記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），則不需要二抗。但這樣成本很高，因?yàn)橐环N一抗只識(shí)別一種底物。所以如今的設(shè)計(jì)一般是二抗帶上可檢測(cè)標(biāo)記，再來檢測(cè)一抗。而一抗識(shí)別底物。這樣，當(dāng)一抗結(jié)合到底物上，就可以通過二抗檢測(cè)出來。
應(yīng)用[4][5]
用于綿羊IgG2 Fc受體（Fcγ2R）基因克隆與表達(dá)研究
Fc受體(FcR)為特異親和免疫球蛋白(Ig)Fc片段的細(xì)胞表面分子,廣泛表達(dá)于免疫輔助細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞,具有許多重要的生理功能,是體液免疫與細(xì)胞免疫的聯(lián)系紐帶,在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。目前僅人和小鼠的三類IgG Fc受體(FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγⅢ)研究的較為深入。牛IgG2 Fc受體(boFcγ2R)是一類新型的FcγR,與人IgA Fc受體(huFcαRI)同源,胞外區(qū)含有2個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域,通過遠(yuǎn)膜端結(jié)構(gòu)域(ECl)與牛IgG2特異結(jié)合。
利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù),首次克隆了綿羊IgG2 Fc受體cDNA。即用boFcγ2R氨基酸序列檢索NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)(tBLASTn),發(fā)現(xiàn)了多個(gè)高同源序列。再采用cDNA快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)從綿羊外周血白細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增到了3’端以及編碼區(qū)cDNA,通過序列拼接得到全長(zhǎng)cDNA序列。
獲得了綿羊IgG2 Fc受體(Fcγ2R)基因,命名為ovFcγ2R。ovFcγ2R全長(zhǎng)1526 bp,包括126bp短的5’端非翻譯區(qū)和620bp長(zhǎng)的3’端非翻譯區(qū),ORF(open reading frame)全長(zhǎng)780bp,編碼259氨基酸的糖蛋白。前18個(gè)氨基酸為預(yù)測(cè)的N端信號(hào)肽序列,胞外區(qū)四個(gè)半胱氨酸殘基形成Ig樣結(jié)構(gòu)的兩個(gè)二硫鍵,19個(gè)氨基酸組成的疏水跨膜區(qū)和15個(gè)氨基酸的胞內(nèi)區(qū)。
胞外區(qū)有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。同時(shí)為深入研究ovFcγ2R受體的結(jié)構(gòu)與功能,將ovFcγ2R胞外區(qū)cDNA亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中表達(dá)了ovFcγ2R胞外區(qū),SDS-PAGE和Western證明重組蛋白以包涵體的形式高效表達(dá)。
參考文獻(xiàn)
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[2]Decreased transcription of the human FCGR2B gene mediated by the-343 G/C promoter polymorphism and association with systemic lupus erythematosus[J].Marissa C.Blank,Radu N.Stefanescu,Emi Masuda,Francesc Marti,Philip D.King,Patricia B.Redecha,Robert J.Wurzburger,Margaret G.E.Peterson,Shizuko Tanaka,Luminita Pricop.Human Genetics.2005(2-3)
[3]A Newly Discovered Fc Receptor that Explains IgG-Isotype Disparities in Effector Responses[J].Silvia Bolland.Immunity.2005(1)
[4]FcγRIV:A Novel FcR with Distinct IgG Subclass Specificity[J].Falk Nimmerjahn,Pierre Bruhns,Ken Horiuchi,Jeffrey V.Ravetch.Immunity.2005(1)
[5]段艷華.綿羊IgG2 Fc受體（Fcγ2R）基因克隆與表達(dá)[D].河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.