背景[1-3]
ANTI-PARKIN抗體是ANTI-PARKIN為抗原制得的免疫抗體，可以特異性結(jié)合PARKIN。主要用于檢測PARKIN的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實驗。
分子遺傳學(xué)研究證明parkin基因是常染色體隱性遺傳性少年型帕金森綜合征(AR-JP)的致病基因,其表達(dá)產(chǎn)物parkin蛋白具有E3泛素-蛋白連接酶活性.Parkin蛋白可能在維持多巴胺能神經(jīng)元的正常功能中發(fā)揮重要作用,而parkin蛋白功能障礙可能與帕金森病的發(fā)病有關(guān)。
目前已經(jīng)鑒定了幾種parkin蛋白的底物蛋白,使我們能夠初步了解帕金森病發(fā)病的分子和細(xì)胞學(xué)機(jī)理,這對于我們最終搞清帕金森病的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)相應(yīng)的治療藥物具有極其重要的意義。
過度表達(dá)的parkin可能通過增強(qiáng)對底物蛋白的泛素化而加強(qiáng)其降解，減少由α-synuclein過度表達(dá)產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。parkin是散發(fā)性PD患者腦中選擇性S-硝基化的蛋白。氧化和硝基化應(yīng)激促進(jìn)parkin蛋白的S-硝基化，從而破壞了parkin的E3泛素連接酶功能和神經(jīng)保護(hù)作用。
而UPS功能缺陷會導(dǎo)致錯誤折疊的α-synuclein單體及寡聚體降解受阻、胞漿內(nèi)LB的形成及多巴胺神經(jīng)元變性死亡。α-synuclein聚集后可損害蛋白酶體系統(tǒng)。α-synuclein低聚體結(jié)合位于蛋白酶體外圍的帽狀結(jié)構(gòu)19S亞單位S6，由于聚集狀態(tài)的α-synuclein體積大且以共價鍵交聯(lián)結(jié)合，會抑制其它蛋白結(jié)合并影響20S的功能，導(dǎo)致異常蛋白聚集?？梢?，α-synuclein聚集與UPS功能缺陷互為因果，加速了胞漿內(nèi)LB的形成及多巴胺神經(jīng)元變性死亡。
應(yīng)用[4][5]
用于Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在糖尿病心肌病中的作用研究
構(gòu)建糖尿病心肌病模型,觀察Pink1/Parkin通路及線粒體自噬水平在糖尿病心肌病中的變化。利用Parkin基因敲除小鼠和培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞,在在體和離體水平明確Pink1/Parkin通路是否參與糖尿病心肌損害的發(fā)生。原代心肌細(xì)胞過表達(dá)Parkin后給予自噬抑制劑3-MA,證實Pink1/Parkin通路通過調(diào)節(jié)線粒體自噬參與糖尿病心肌病的發(fā)生。
【研究方法】1.挑選40只8周齡,體重18~22g的C57雄性小鼠,隨機(jī)分為2組:正常組(Control)和糖尿病心肌病組(DM)。2.DM組小鼠每天以50 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ),連續(xù)注射5天,檢測空腹血糖大于11.1mmol/L確定為糖尿病造模成功。造模成功后,繼續(xù)飼養(yǎng)8周,建立糖尿病心肌病模型。超聲檢測小鼠心臟功能。
3. HE和MASSON染色觀察心肌組織的病理改變。4.TUNEL法檢測心肌組織中心肌細(xì)胞的凋亡。5.透射電鏡下觀察小鼠心肌組織中線粒體的形態(tài)和自噬體的形成。6.Western-blot檢測心肌組織中Pink1、Parkin、Mfn1、Mfn2、Nix、Beclin1、P62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的蛋白水平。
7. 將C57和Parkin-/-小鼠隨機(jī)分為四組:正常C57小鼠組(WT),糖尿病C57小鼠組(WT-STZ),正常Parkin基因敲除小鼠組(Parkin)和糖尿病Parkin基因敲除小鼠組(Parkin-STZ)。糖尿病模型建成后,繼續(xù)飼養(yǎng)8周。8周末,超聲檢測各組小鼠的心功能。
8. 培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞,隨機(jī)分為以下6組:A:陰性對照組(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Lac Z;B:正常Parkin過表達(dá)組(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Parkin;C:正常Parkin過表達(dá)+3-MA干預(yù)組(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Parkin+3-MA;D:高糖陰性對照組(33 mmol/L葡萄糖):HG+Lac Z;E:高糖Parkin過表達(dá)組(33 mmol/L葡萄糖):HG+Parkin;F:高糖Parkin過表達(dá)+3-MA干預(yù)組(33 mmol/L葡萄糖):HG+Parkin+3-MA。9.TUNEL法檢測原代心肌細(xì)胞的凋亡。
10.透射電鏡下觀察原代心肌細(xì)胞中線粒體的形態(tài)和自噬體的形成。11.熒光顯微鏡觀察心肌細(xì)胞中GFP-LC3陽性的細(xì)胞數(shù)。12.Western-blot檢測心肌細(xì)胞中Pink1、Parkin、Mfn1、Mfn2、Drp1、Nix、Beclin1、P62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的蛋白水平。
參考文獻(xiàn)
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[5]王佳興.Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在糖尿病心肌病中的作用[D].第四軍醫(yī)大學(xué),2015.