背景[1-3]
ANTI-BAK抗體是用人工合成的人Bak蛋白Gly82附近一段多肽進行適當修飾后免疫rabbit，然后用protein A和抗原多肽親和柱經(jīng)過兩步純化得到的高純度抗體。Bak抗體識別的是總Bak(total Bak)，可以檢測內(nèi)源性的Bak蛋白水平，未發(fā)現(xiàn)和其它Bal-2家族蛋白有交叉反應(yīng)。BAK抗體產(chǎn)品為無色溶液形式，含有100 ug抗體.該產(chǎn)品濃度為0.5 mg/ml，溶解于包含有30%甘油，0.5%BSA，5 mM EDTA和0.01%硫柳汞的PBS（pH 7.2）緩沖液中。
Bak基因是一個新發(fā)現(xiàn)的bcl-2家族的同源類似物，具有211個氨基酸(約23.4 kDa)，能夠促進細胞死亡，且對抗bcl-2對凋亡的保護作用。Bak與bcl_2及其家族成員有明顯結(jié)構(gòu)上的相似性，特別是BHI和B也結(jié)構(gòu)域。Bak與bcl-2、bcl-xL和Bax的同源性分別有25％、22％和19％。Bak在碳末端還含有疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域，說明Bak蛋白以整合的膜蛋白的形式存在。
近兩年來，對Bak基因的研究逐漸深入。像Bax一樣，Bak基因產(chǎn)物能夠增加細胞對各種刺激的凋亡性反應(yīng)。Bak基因確實能夠顯著誘導(dǎo)HCC-9204細胞(p53基因已突變)發(fā)生凋亡。Bak基因可能作為p53基因突變的腫瘤中誘導(dǎo)細胞凋亡的效應(yīng)分子，直接參與凋亡的發(fā)生。最近Manchester大學(xué)癌癥研究中心的一個小組針對Bak基因進行了研究，發(fā)現(xiàn)Bak能夠接受藥物引起的細胞凋亡信號并引起細胞損傷，Bak基因在正常情況下受到其它分子的控制。
為了達到活性狀態(tài)，Bak必須脫離目前的“記憶狀態(tài)”并發(fā)生蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。一旦構(gòu)象發(fā)生改變，Bak就會接受細胞損傷性刺激并誘導(dǎo)細胞死亡，因此，通過體外轉(zhuǎn)染Bak基因，增加細胞中Bak的表達，從而誘導(dǎo)細胞凋亡，這可能作為腫瘤基因治療的一個新策略，特別是針對p53基因已發(fā)生突變的腫瘤。
應(yīng)用[4][5]
用于樺木醇誘導(dǎo)的人源癌細胞凋亡過程中Bax、Bak以及Caspase-9重要調(diào)控作用的研究
活化的Caspases參與一系列蛋白質(zhì)的降解作用,最終導(dǎo)致細胞的死亡。通常有兩條主要途徑激活Caspases:一條是通過細胞表面死亡受體途徑,例如特異性配體結(jié)合的Fas等腫瘤壞死因子(TNF)家族,導(dǎo)致Caspase-8的激活,Caspase-8再依次激活下游的效應(yīng)Caspase,如Caspase-3,-6,和-7；
另一條是線粒體途徑,細胞內(nèi)細胞凋亡信號觸發(fā)線粒體釋放cytochrome c,隨后cytochrome c與胞漿中的凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)結(jié)合,后者募集Caspase-9并誘導(dǎo)其加工和激活。
線粒體外膜通透性的改變和cytochrome c的釋放受Bcl-2家族蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié),Bcl-2家族中促凋亡蛋白質(zhì)分子Bax和Bak可做特定的蛋白質(zhì)釋放通道。
細胞凋亡的失衡可引起腫瘤細胞的過度增殖以及其對抗癌藥物的耐受,闡明細胞凋亡過程的分子機制,從而找到實施有效細胞凋亡方法,是治療人類癌癥的理想策略。
樺木醇(Betulin,BT),是一種天然存在的五環(huán)三萜類化合物,大量存在于灌木樹中,其含量高達樺樹皮干重的30%。因為樺木醇具有多種藥理學(xué)性質(zhì),故可做化學(xué)藥物的前體化合物。目前,在結(jié)構(gòu)上與樺木醇的衍生物樺木酸,被證實具有細胞毒性作用,對多種腫瘤細胞都顯現(xiàn)出細胞毒性。
選用人源宮頸癌細胞HeLa作為實驗?zāi)Ｐ?對樺木醇抗癌細胞活性的分子機制進行研究。通過細胞形態(tài)學(xué)分析觀察到：膜起泡、細胞核的凝縮和斷裂以及凋亡小體的形成等典型的細胞凋亡現(xiàn)象。免疫印跡分析發(fā)現(xiàn),樺木醇作用HeLa細胞8小時,細胞凋亡標志性蛋白質(zhì),Caspase-3的底物PARP出現(xiàn)斷裂。
參考文獻
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