背景[1-3]
Anti-c-Myc tag抗體(HRP)是一類可以特異性結(jié)合c-Myc tag的多克隆抗體，主要用于檢測c-Myc tag的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實驗。
檢測原理：雙抗體夾心法測定標(biāo)本中c-Myc tag水平。用純化的c-Myc tag抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入c-Myc tag，再與HRP標(biāo)記的c-Myc tag抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的c-Myc tag呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中c-Myc tag濃度。
標(biāo)簽蛋白抗體是一類經(jīng)過親和純化的小鼠單克隆抗體。用于檢測各種商品化表達載體上的標(biāo)簽序列（如：MyC、His、GST、HA等），籍以分析檢測目的蛋白的表達含量及其功能。其原理是抗原—抗體反應(yīng)，這些標(biāo)簽抗體可以高度特異地結(jié)合對應(yīng)的標(biāo)簽融合蛋白。標(biāo)簽抗體是開展基因蛋白表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因功能研究的常用工具。
c-MycTag多肽（c-Myc Tag Peptide）是一種合成的多肽，其氨基酸序列相當(dāng)于人c-Myc蛋白C-末端的410-419序列。c-Myc Tag多肽是c-Myc融合蛋白的替代品，在免疫分析實驗中用于競爭性結(jié)合anti-c-Myc抗體，c-Myc Tag多肽與抗體的結(jié)合是特異性的，因此，c-Myc Tag多肽是一種溫和的、理想試劑可用于洗脫與anti-Myc單抗結(jié)合的Myc-tag融合蛋白。
應(yīng)用[4][5]
用于周期蛋白G2結(jié)合蛋白的篩選及初步功能研究
周期蛋白G2由定位于染色體4q21.21的CCNG2基因編碼，N端有典型的周期蛋白框序列，C端含PEST基序。周期蛋白G2在小腦、胸腺、脾、前列腺和腎臟中表達較高，在細胞中主要分布于細胞質(zhì)。周期蛋白G2的mRNA表達水平隨細胞周期波動，表現(xiàn)為在晚S期最高，而在G2／M期開始降低。
研究顯示，周期蛋白G2在HEK293和CHO(Chinese hamster ovary)細胞中瞬時表達可導(dǎo)致G1期停滯；進一步發(fā)現(xiàn)，周期蛋白G2的細胞生長抑制作用與周期蛋白G2-蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)復(fù)合物密切相關(guān)。
構(gòu)建了周期蛋白G2與GAL4-BD的融合蛋白的表達載體，以周期蛋白G2為誘餌，應(yīng)用MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3，篩選預(yù)轉(zhuǎn)入酵母Y187的人胎腦cDNA文庫(Pretransformed MATCHMAKER Human Fetal Brain cDNA Library)。選擇58個克隆進行序列分析，結(jié)果表明它們代表35種不同cDNA，其中PPP2R5B(Homo sapiens protein phosphatase 2,regulatory subunit B(B56),beta isoform)是已經(jīng)報道過的與周期蛋白G2結(jié)合的PP2A的B56β。
另外，有三種cDNA在陽性克隆中出現(xiàn)的重復(fù)次數(shù)較多，即有8個克隆為DAPPER1 cDNA、3個克隆為BPY2IP1 cDNA以及3個克隆為Clorfl87 cDNA。
為了驗證DAPPER1、BPY2IP1和Clorfl87與周期蛋白G2的結(jié)合，構(gòu)建了真核表達載體pCMV-Tag5A-DAPPER1、pCMV-Tag5C-BPY2IP1和pCMV-Tag5B-Clorfl87，與p3×Flag-7.1-G2共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，以結(jié)合有c-myc標(biāo)簽抗體的瓊脂糖樹脂(Anti-c-Myc Agarose conjugate)沉淀與DAPPER1、BPY2IP1和Clorfl87結(jié)合的復(fù)合物。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后用Flag單抗進行Western Blot檢測。
參考文獻
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