背景[1-3]
絲裂原活化蛋白激酶P38(抗體)是一類可以特異性結(jié)合絲裂原活化蛋白激酶P38的多克隆抗體，主要用于檢測絲裂原活化蛋白激酶P38的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實驗。
檢測原理：雙抗體夾心法測定標(biāo)本中絲裂原活化蛋白激酶P38水平。用純化的絲裂原活化蛋白激酶P38抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入絲裂原活化蛋白激酶P38，再與HRP標(biāo)記的絲裂原活化蛋白激酶P38抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的絲裂原活化蛋白激酶P38呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中絲裂原活化蛋白激酶P38濃度。
絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一組能被不同的細胞外刺激，如細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細胞應(yīng)激及細胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。由于MAPK是培養(yǎng)細胞在受到生長因子等絲裂原刺激時被激活而被鑒定的，因而得名。
所有的真核細胞都能表達MAPK。MAPK通路的基本組成是一種從酵母到人類都保守的三級激酶模式，包括MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK，這三種激酶能依次激活，共同調(diào)節(jié)著細胞的生長、分化、對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細胞生理/病理過程。
應(yīng)用[4][5]
用于七鰓鰻絲裂原活化蛋白激酶P38α、β分子的克隆、重組表達及相關(guān)免疫學(xué)研究
以P38MAPK作為研究對象,探索P38MAPK在七鰓鰻中是否存在,以及在七鰓鰻免疫防御過程中所起的作用。這樣不僅可以揭示P38MAPK分子家族從低等到高等脊椎動物的分子進化過程,也為進一步深入了解無頜類脊椎動物免疫應(yīng)答的分子機制奠定基礎(chǔ)。
利用多種生物信息學(xué)分析軟件對其蛋白一級、二級及三級結(jié)構(gòu)進行了多種分析并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹,探討了P38MAPK家族分子的分子進化機制,為以后實驗的設(shè)計和實施打下了良好的理論基礎(chǔ)。
在成功的克隆了Lja-MAPK14和Lja-MAPK11的基礎(chǔ)上,又成功的構(gòu)建了Lja-MAPK14和Lja-MAPK11的重組表達質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)化到表達菌株E.coli BL21中進行了表達。對其可溶性進行檢測發(fā)現(xiàn)Lja-MAPK14和Lja-MAPK11均以包涵體的形式表達,并且兩者皆可利用人源P38的多克隆抗體通過免疫印跡方法進行檢測。
為了進一步了解Lja-MAPK14和Lja-MAPK11的功能,通過半定量PCR,實時定量PCR和免疫印跡等方法檢測了它們在免疫相關(guān)組織中隨免疫應(yīng)答時間變化在mRNA和蛋白水平的表達譜。
利用免疫熒光方法檢測了Lja-MAPK14和Lja-MAPK11在類淋巴細胞中的定位。實時定量PCR和免疫印跡的結(jié)果表明,混合菌免疫后Lja-MAPK14和Lja-MAPK11在單個核白細胞和髓樣小體中都出現(xiàn)了明顯的上調(diào)現(xiàn)象。
免疫熒光方法檢測發(fā)現(xiàn),Lja-MAPK14/Lja-MAPK11(P38MAPK)與VLRB~+淋巴細胞存在共定位現(xiàn)象。同時,P38MAPK在混合菌免疫后還出現(xiàn)了入核的現(xiàn)象。
參考文獻
[1]p38 MAP kinases in the heart[J].Tomohiro Yokota,Yibin Wang.Gene.2016(2)
[2]Gene structure,molecular characterization and transcriptional expression of two p38 isoforms(MAPK11 and MAPK14)from rock bream(Oplegnathus fasciatus)[J].Navaneethaiyer Umasuthan,S.D.N.K.Bathige,Jae Koo Noh,Jehee Lee.Fish and Shellfish Immunology.2015(1)
[3]p38 MAPK:stress responses from molecular mechanisms to therapeutics[J].Lydia R.Coulthard,Danielle E.White,Dominic L.Jones,Michael F.McDermott,Susan A.Burchill.Trends in Molecular Medicine.2009(8)
[4]Regulation of JNK and p38 MAPK in the immune system:Signal integration,propagation and termination[J].Gonghua Huang,Lewis Zhichang Shi,Hongbo Chi.Cytokine.2009(3)
[5]張依杉.七鰓鰻絲裂原活化蛋白激酶P38α、β分子的克隆、重組表達及相關(guān)免疫學(xué)研究[D].遼寧師范大學(xué),2018.