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綠色熒光蛋白(GFP)性能簡介

2020/10/25 9:01:40

由水母Aequorea victoria中發(fā)現(xiàn)的野生型綠色熒光蛋白,395nm和475nm分別是和次大的激發(fā)波長,它的發(fā)射波長的峰點是在509nm,在可見光綠光的范圍下是較弱的位置。由海腎(sea pansy)所得的綠色熒光蛋白,僅有在498nm有一個較高的激發(fā)峰點。

在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域中,綠色熒光蛋白基因常被用作為一個報導(dǎo)基因(reporter gene)。一些經(jīng)修飾過的型式可作為生物探針,綠色熒光蛋白基因也可以克隆到脊椎動物(例如:兔子上進(jìn)行表現(xiàn),并拿來映證某種假設(shè)的實驗方法。

蛋白形態(tài)

綠色熒光蛋白分子的形狀呈圓柱形,就像一個桶,負(fù)責(zé)發(fā)光的基團位于桶中央,因此,綠色熒光蛋白可形象地比喻為一個裝有色素的“油漆桶”。裝在“桶”中的發(fā)光基團對藍(lán)色光照特別敏感。當(dāng)它受到藍(lán)光照射時,會吸收藍(lán)光的部分能量,然后發(fā)射出綠色的熒光。利用這一性質(zhì),生物學(xué)家們可以用綠色熒光蛋白來標(biāo)記幾乎任何生物分子或細(xì)胞,然后在藍(lán)光照射下進(jìn)行顯微鏡觀察。原本黑暗或透明的視場馬上變得星光點點——那是被標(biāo)記了的活動目標(biāo)。對生物活體樣本的實時觀察,在綠色熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用以前,是根本不可想象的。而這種徹底改變了生物學(xué)研究的蛋白質(zhì),最初是從一種廣泛生活于太平洋海域的發(fā)光水母體內(nèi)分離得到的。

在大自然中,具有發(fā)光能力的生物有不少,螢火蟲是陸地上最為我們所熟悉的發(fā)光生物,中國古代還有“捕螢數(shù)百入囊內(nèi)照明夜讀”的佳話。在海洋里,某些水母、珊瑚和深海魚類也有發(fā)光的能力。特別是有的肉食性魚類專門靠一條閃著熒光的觸角來把其他小魚吸引到自己的嘴邊,《海底總動員》里就有這種魚。事實上,大多數(shù)發(fā)光動物能發(fā)光是靠兩種物質(zhì)——熒光素和熒光素酶——合作產(chǎn)生的結(jié)果。不同發(fā)光生物的熒光素和熒光素酶結(jié)構(gòu)是不一樣的。因此,這些生物的發(fā)光本領(lǐng)只能是它們自己的“專利”。

20世紀(jì)60年代,一位日本科學(xué)家從美國西岸打撈了大量發(fā)光水母,帶回位于華盛頓州的實驗室進(jìn)行研究。這些水母在受到外界的驚擾時會發(fā)出綠色的熒光,這位科學(xué)家希望找到這種水母的熒光素酶。然而,經(jīng)過長期的重復(fù)努力,居然毫無收獲。他大膽地假設(shè),這種學(xué)名叫Aequorea victoria的水母能發(fā)光也許并不是常規(guī)的熒光素/熒光素酶原理。他想,可能存在有另一種能產(chǎn)生熒光的蛋白。此后,他進(jìn)行了更多的實驗,終于搞清楚了這種水母的特殊發(fā)光原理。原來,在這種水母的體內(nèi)有一種叫水母素的物質(zhì),在與鈣離子結(jié)合時會發(fā)出藍(lán)光,而這道藍(lán)光未經(jīng)人所見就已被一種蛋白質(zhì)吸收,改發(fā)綠色的熒光。這種捕獲藍(lán)光并發(fā)出綠光的蛋白質(zhì),就是綠色熒光蛋白。這位日本科學(xué)家也因為這項發(fā)現(xiàn),獲得了剛剛頒發(fā)的諾貝爾化學(xué)獎,他就是日本科學(xué)家下村修。

蛋白作用

綠色熒光蛋的發(fā)光機理比熒光素/熒光素酶要簡單得多。一種熒光素酶只能與相對應(yīng)的一種熒光素合作來發(fā)光,而綠色熒光蛋白并不需要與其他物質(zhì)合作,只需要用藍(lán)光照射,就能自己發(fā)光。

在生物學(xué)研究中,科學(xué)家們常常利用這種能自己發(fā)光的熒光分子來作為生物體的標(biāo)記。將這種熒光分子通過化學(xué)方法掛在其他不可見的分子上,原來不可見的部分就變得可見了。生物學(xué)家一直利用這種標(biāo)記方法,把原本透明的細(xì)胞或細(xì)胞器從黑暗的顯微鏡視場中“揪出來”。

傳統(tǒng)的熒光分子在發(fā)光的同時,會產(chǎn)生具有毒性的氧自由基,導(dǎo)致被觀察的細(xì)胞死亡,這叫做“光毒性”,因此,在綠色熒光蛋白發(fā)現(xiàn)以前,科學(xué)家們只能通過熒光標(biāo)記來研究死亡細(xì)胞靜態(tài)結(jié)構(gòu),而綠色熒光蛋白的光毒性非常弱,非常適合用于標(biāo)記活細(xì)胞。

然而,綠色熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)20多年后,才有人將其應(yīng)用在生物樣品標(biāo)記上。1993年,馬丁·沙爾菲成功地通過基因重組的方法使得除水母以外的其他生物(如大腸桿菌等)也能產(chǎn)生綠色熒光蛋白,這不僅證實了綠色熒光蛋白與活體生物的相容性,還建立了利用綠色熒光蛋白研究基因表達(dá)的基該方法,而許多現(xiàn)代重大疾病都與基因表達(dá)的異常有關(guān)。至此,生物醫(yī)學(xué)研究的一場“綠色革命”揭開了序幕。

后來,美籍華人錢永健系統(tǒng)地研究了綠色熒光蛋白的工作原理,并對它進(jìn)行了大刀闊斧的化學(xué)改造,不但大大增強了它的發(fā)光效率,還發(fā)展出了紅色、藍(lán)色、黃色熒光蛋白,使得熒光蛋白真正成為了一個琳瑯滿目的工具箱,供生物學(xué)家們選用。目前生物實驗室普遍使用的熒光蛋白,大部分是錢永健改造的變種。

有了這些熒光蛋白,科學(xué)家們就好像在細(xì)胞內(nèi)裝上了“攝像頭”,得以實時監(jiān)測各種病毒“為非作歹”的過程。通過沙爾菲的基因克隆思路,科學(xué)家們還培育出了熒光老鼠和熒光豬,由于沙爾菲與錢永健的突出貢獻(xiàn),他們與綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)者下村修共享了2008年的諾貝爾化學(xué)獎。

瑞典皇家科學(xué)院將綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和改造與顯微鏡的發(fā)明相提并論,成為當(dāng)代生物科學(xué)研究中最重要的工具之一。

蛋白性質(zhì)

GFP熒光極其穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強,特別在450~490nm藍(lán)光波長下更穩(wěn)定。GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光,強還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问剑坏┲匦卤┞对诳諝饣蜓鯕庵?,GFP熒光便立即得到恢復(fù)。而一些弱還原劑并不影響GFP熒光。中度氧化劑對GFP熒光影響也不大,如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等。

GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強,因此更適用于定量測定與分析。但因為GFP不是酶,熒光信號沒有酶學(xué)放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白。

由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能,熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。

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