異丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷性質、用途與生產工藝
異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強的誘導劑,不被細菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實驗室廣泛應用。IPTG 常用于需要誘導 β-半乳糖苷酶活性的克隆實驗。它常與 X-Gal 或 Bluo-Gal 結合使用,用于重組細菌菌落的藍白篩選,這些菌落可以誘導 lac 操縱子在大腸桿菌中的表達。IPTG 與 lacI 阻遏蛋白結合并改變其構象而發(fā)揮作用,防止 β-半乳糖苷酶編碼基因 lacZ 的抑制。
E.coli的乳糖操縱子(元)含Z、Y及A三個結構基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙?;D移酶,此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節(jié) 基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白,后者與O序列結合,使操縱子(元)受阻遏而處于關閉狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個分解(代謝)物基因激 活蛋白(CAP)結合位點。由P序列、O序列和CAP結合位點共同構成lac操縱子的調控區(qū),三個酶的編碼基因即由同一調控區(qū)調節(jié),實現(xiàn)基因產物的協(xié)調表達 。
在沒有乳糖存在時,lac操縱子(元)處于阻遏狀態(tài)。此時,I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合,阻礙RNA聚合酶與P序列結 合,抑制轉錄起動。當有乳糖存在時,lac操縱子(元)即可被誘導。在這個操縱子(元)體系中,真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞,經β-半乳糖苷酶催化,轉變?yōu)楫惾樘恰:笳咦鳛橐环N誘導劑分子結合阻遏蛋白,使蛋白構象變化,導致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉錄。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的作用與異乳糖相同,是一 種作用極強的誘導劑,不被細菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實驗室廣泛應用。
1.能誘導酶的合成,但又不被分解的分子,稱為安慰誘導物。由于乳糖雖可誘導酶的合成,但又隨之分解,產生很多復雜的動力學問題,因此人們常用安慰誘導物來進行各種實驗。
2.IPTG不被菌體代謝,為乳糖類似物,一旦進入細胞就會產生持續(xù)長久的誘導效果,所以IPTG的誘導效率高,往往只需要很少量(1mmol/L)即可達到理想誘導效果。由于IPTG不被代謝,在胞內專一誘導外源蛋白的表達。不受細胞代謝的影響,誘導效果持續(xù)穩(wěn)定。乳糖有雙效作用,既能做為誘導劑異乳糖的前體物質,又可以做碳源,在誘導過程中,很不穩(wěn)定,IPTG因其優(yōu)異的穩(wěn)定性決定了它適合做實驗研究用。
3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。
4.半乳糖苷鍵中用硫代替了氧,失去了水解活性,但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物與酶位點的親和力相同,IPTG雖不為β–半乳糖苷酶所識別,但它是lac基因簇十分有效的誘導物。
使用方法:首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液,并進行過濾除菌后保存。然后在100 ml的瓊脂培養(yǎng)基中,加入100 μl的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml),制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培養(yǎng)基。當dna片段插入至pUC系列載體(或其他帶有l(wèi)acZ、Amp基因載體),然后轉化至lacZ缺失細胞中后,涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培養(yǎng)基,可根據(jù)長出菌體的藍白色,而方便地挑選出基因重組體(白色為具有DNA插入片段的基因重組體)。
1、誘導表達材料:
( 1 ) LB (Luria—Bertani))培養(yǎng)基:
酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g
NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%
蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0
適用范圍:大腸桿菌
( 2 ) IPTG 貯備液:
2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中,0 . 22 μm 濾膜過濾除菌,分裝成1 mL /份,-20 ℃ 保存.
( 3 ) l× 凝膠電泳加樣緩沖液:
50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )
50 mmol / L DTT
2 % SDS (電泳級)
0.1 % 溴酚藍
10 % 甘油
2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料:
1 )酶溶法
(1)裂解緩沖液:
50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
1 mmol / L EDTA
100 mmol / LNaCI
(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF ).
(3)10 mg / mL 溶菌酶.
(4)脫氧膽酸.
(5)1 mg / mL DNase I.
2 )超聲破碎法
( 1 ) TE 緩沖液.
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液:
100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
100 mmol / L DTT
4 %SDS
0.2 % 溴酚藍
20 % 甘油
1、外源基因的誘導表達:
(1)用適當?shù)南拗菩詢惹泻怂崦赶d體DNA 和目的基因.
( 2 )按連接步驟連接目的基因和載體,并轉化到相應的宿主菌.
( 3 )篩選出含重組子的轉化菌落,提取質粒DNA 作限制性內切核酸酶圖譜,DNA 序列測定,
確定無誤后進行下一步.
( 4 )如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子,則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時,使培養(yǎng)液的OD600達0.4-0.6 ,迅速使溫度升至42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ;如果表達載體的原核啟動子為tac 等,則37 ℃培養(yǎng)細菌數(shù)小時達到對數(shù)生長期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L.繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h .
( 5 )取上述培養(yǎng)液1 mL , 1000g 離心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后,作SDS -PAGE 檢測.
2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質純化:
細菌的裂解
常用方法有:① 高溫珠磨法;② 高壓勻漿;③ 超聲破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化學滲透等.前三種方法屬機械破碎法,并且方法① 、② 已在工業(yè)生產中得到應用,后三種方法在實驗室研究中應用較為廣泛.下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟.
酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;殼多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要對細菌類有作用,而其他幾種酶對酵母作用顯著.主要步驟為:
4 ℃ ,5000rpm 離心,15 min ,收集誘導表達的細菌培養(yǎng)液(100 mL ).棄上清,約每克濕菌加3 mL 裂解緩沖液,懸浮沉淀.
用途
常用分子生物學試劑,常用于藍白斑篩選及IPTG誘導的細菌內的蛋白表達等
用途
是β-半乳糖苷酶和β-半乳糖透酶的誘導劑,不被β-半乳糖苷水解,是硫代半乳糖轉酰酶的底物
用途
IPTG 常用于需要誘導 β-半乳糖苷酶活性的克隆實驗。它常與 X-Gal 或 Bluo-Gal 結合使用,用于重組細菌菌落的藍白篩選,這些菌落可以誘導 lac 操縱子在大腸桿菌中的表達。IPTG 與 lacI 阻遏蛋白結合并改變其構象而發(fā)揮作用,防止 β-半乳糖苷酶編碼基因 lacZ 的抑制。
異丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷
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