人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞
細(xì)胞術(shù)檢測樣品制備方法A. 直接標(biāo)記抗體(FITC標(biāo)記抗體)：
(1) 收集1×106個(gè)細(xì)胞，800rpm離心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
(2) 用4%多聚甲醛1ml室溫固定40分鐘，800rpm離心5min去上清。加2ml PBS重懸洗滌細(xì)胞，800rpm離心5min。
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重懸細(xì)胞，冰上孵育10min，800rpm離心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和飽和劑量的熒光標(biāo)記抗體(5×105個(gè)細(xì)胞/20ul抗體)的PBS ,避光冰上放置30min,離心棄上清。加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待測即可。
(4) 用流式細(xì)胞儀檢測熒光值,每管計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。[2]
B. 未標(biāo)記抗體間接免疫熒光標(biāo)記法：
(1)收集2×106個(gè)細(xì)胞，用冷的PBS 2ml 洗滌細(xì)胞一次，800rpm離心5min。
(2)用2ml 4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞40min,800rpm離心5min；2ml PBS重懸細(xì)胞，800rpm離心5min；
(3)用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重懸細(xì)胞，冰上放置10min,800rpm離心5min。
(4)加入飽和劑量未標(biāo)記抗體，冰上放置40min,800rpm離心5min，用2ml冷的PBS 重懸細(xì)胞，800rpm離心5min，洗去未結(jié)合一抗，重復(fù)一次。
(5)加入熒光標(biāo)記(FITC)標(biāo)記的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm離心5min，去上清，PBS洗滌兩次。
(6)加入0.5ml 1%多聚甲醛重懸細(xì)胞；固定待測。
(7)流式細(xì)胞儀檢測熒光值,每管計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。
C.細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及DNA倍體分析樣品(PI染色)的制備：
(1)待測樣本制成單細(xì)胞懸液，然后200g離心5分鐘，棄上清。
(2)用4℃預(yù)冷的70%冷乙醇固定，4℃保存 ，至少固定18小時(shí)。
(3)調(diào)整細(xì)胞濃度為106細(xì)胞/毫升，取1毫升細(xì)胞懸液，用PBS洗三次，細(xì)胞重懸于1毫升PI染液中，37℃孵育30分鐘即可進(jìn)行流式分析。
(4)PI染液終濃度為50微克/毫升，RNase A終濃度為20微克/毫升。
人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞

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