圖1. 雙抗體夾心ELISA原理圖。
一個包裝的本試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)品檢測，可以進(jìn)行96次檢測。
保存條件：
除標(biāo)準(zhǔn)品外，4℃保存6個月內(nèi)有效。標(biāo)準(zhǔn)品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個月內(nèi)有效。
注意事項：
由于標(biāo)準(zhǔn)品一般是凍干粉，在制備后需要嚴(yán)格校準(zhǔn)，所以標(biāo)準(zhǔn)品的瓶數(shù)及每瓶標(biāo)準(zhǔn)品所需加入的稀釋液體積請以實際收到的試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上的標(biāo)注為準(zhǔn)。
洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
TMB對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當(dāng)防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
加樣時，請注意每個樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
不宜混用不同批號的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過獨立測試。
充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準(zhǔn)性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
本試劑盒很多操作在室溫進(jìn)行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。
洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。
加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 樣品準(zhǔn)備
a. 樣品的準(zhǔn)備請按下列流程進(jìn)行操作：
(a) 細(xì)胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b) 對于血清樣品，將全血在室溫放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c) 對于血漿樣品，采集的全血使用肝素或者EDTA進(jìn)行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d) 若待測樣品不能及時檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復(fù)凍融。
b. 血清樣品不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑。
c. 樣品應(yīng)清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。
d. 請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。
注：血清或血漿樣品可能需要用樣品分析緩沖液適當(dāng)稀釋后再檢測。
2. 檢測前準(zhǔn)備工作
a. 試劑盒從冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25-28℃)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。
b. 配制適當(dāng)量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
c. 按標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上標(biāo)注的體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至1瓶標(biāo)準(zhǔn)品中，室溫孵育15分鐘(為確保標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標(biāo)準(zhǔn)品徹底溶解，使標(biāo)準(zhǔn)品終濃度達(dá)到4000pg/ml。通常每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品需要檢測2個孔，每個孔的標(biāo)準(zhǔn)品用量為100μl，共需200μl，同時稀釋時還需要使用250μl，因此如果1瓶標(biāo)準(zhǔn)品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，并在合并混勻后使用。
d. 取5個潔凈的1.5毫升離心管，每管預(yù)先加入250μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，并參考圖2進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋，最終得到4000、2000、1000、500、250、125pg/ml共六個標(biāo)準(zhǔn)品濃度，最后將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品依次加入預(yù)包被板孔中，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個標(biāo)準(zhǔn)品濃度。
ELISA實驗因靈敏度高，特異性強在生物科研上得到了廣泛的認(rèn)可，但對初學(xué)者而言，如不注意實驗操作過程中的各個環(huán)節(jié)，可能會對最終的實驗結(jié)果產(chǎn)生比較大的影響，比如實驗出現(xiàn)白板，顯色弱靈敏度低，花板無梯度背景高等現(xiàn)象。下面對以上實驗現(xiàn)象進(jìn)行一一解析。
1.白板現(xiàn)象
在完成所有實驗步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中所有孔的顏色均為無色，即無信號呈現(xiàn)。
出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：
a.試劑已過保質(zhì)期，不同批次稀釋液交叉使用。
b.錯加漏加檢測A，檢測B或者底物溶液TMB。
c.洗板或者加樣過程中，酶標(biāo)記物被污染失活，稀釋液中含有酶抑制劑如疊氮吶等。
d.配置稀釋液的蒸餾水可能被污染。
e.洗滌液是濃縮型的，沒有按比例進(jìn)行稀釋。
f.酶標(biāo)記物的活性和效價比較低。
g.溶液的PH值不正確，一般稀釋液的PH值應(yīng)保持在7.2-7.4。
2.顯色弱靈敏度低
在完成所有實驗步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中孔的顯色比較淺，即只有微弱的信號呈現(xiàn)。
出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：
a.產(chǎn)品過有效期，試劑沒有按規(guī)定進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋４妗?/p>
b.試劑，標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品在使用前沒有平衡到室溫。
c.少加了試劑的量或者加入試劑的稀釋比例不當(dāng)。
d.洗板或者加樣過程中，酶標(biāo)物受污染失活。
e.孵育時間和孵育溫度未達(dá)到實驗要求。
f.洗滌液稀釋倍數(shù)不符合要求，洗板次數(shù)過多，洗板沖擊力過大，洗板浸泡時間過長。
g.底物溶液TMB顯色時間太短。
3.花板無梯度背景高
在完成所有實驗步驟進(jìn)行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中的孔有顏色但沒有梯度，背景也可能較高.
出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：
a.底物溶液TMB未置于陰涼避光處保存，實驗前溶液已經(jīng)變藍(lán)。
b.孵育溫度過高或者孵育時間過長，發(fā)生了較強的非特異性吸附。
c.沒有按說明書要求洗板，特別是洗板時洗滌液的量少加了。
d.加樣時沒有換槍頭造成交叉污染。
e.花板現(xiàn)象：低濃度或者低活性的包被抗體或者檢測抗體，封閉不足導(dǎo)致的本底不穩(wěn)定，洗板不充分，包被板子的問題。
綜上所述：在ELISA實驗中應(yīng)注意以下問題：
1.在實驗前應(yīng)該按相關(guān)要求將實驗試劑平衡至室溫。
2.包被抗體和檢測抗體應(yīng)該是有高活性的且都針對同一抗原。
3.試劑保存：蛋白抗體類試劑保存于-20攝氏度，顯色液洗滌液保存于2-8攝氏度。
4.各試劑在使用前應(yīng)充分混勻，以保證試劑的均一性和準(zhǔn)確性。
5.嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)試劑。
6.洗板次數(shù)，洗板液的量，洗板液浸泡時間的長短，洗板的力度都是應(yīng)該注意的問題。
7.相關(guān)濃縮液應(yīng)按要求稀釋到相應(yīng)比例方可使用，PH值要保持在7.2-7.4之間。
8.在終止反應(yīng)時盡量避免微孔中存有氣泡。
9.終止反應(yīng)完成后應(yīng)該在2min內(nèi)完成酶標(biāo)儀讀數(shù)。
特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！