DH10Bac感受態(tài)細胞是用來生產(chǎn)用于真核細胞蛋白表達的重組桿狀病毒分子。
高效DH10Bac細胞含有父Bacmid的bMON14272和輔助質(zhì)粒pMON7124。父Bacmid的包含一個小型F復(fù)制子,卡鈉霉素抗性基因,attTn7重組位點和lacZα互補因子。輔助質(zhì)粒包含的tnsABCD的區(qū)域,提供了轉(zhuǎn)座蛋白,這些轉(zhuǎn)座蛋白可以 供體質(zhì)粒(Donor plasmid)上的小Tn7位點插入到父本Bacmid的重組目的位點。輔助質(zhì)粒pMON7124包含有四環(huán)素抗性(Tetracycline).
DH10Bac感受態(tài)細胞本身含有卡那霉素和四環(huán)素抗性。在制作感受態(tài)細胞的時候,需要加入這兩種抗生素,以防止DH10Bac中的質(zhì)粒父本桿粒bMON14272(卡那霉素抗性)和輔助質(zhì)粒pMON7124(四環(huán)素抗性)在細胞擴增過程中丟失,提高質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的基因轉(zhuǎn)座效率。
攜帶Tn7轉(zhuǎn)座元件的 供體質(zhì)粒pFastBac,含有慶大霉素抗性基因,桿狀病毒多角體啟動子,一個多克隆位點區(qū)域和SV40的poolyadenylation信號。 重組的Bacmid分子通過將多克隆位點包含有基因編碼序列的 供體質(zhì)粒pFastBa質(zhì)粒DH10Ba感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化與在編碼序列克隆到多個克隆網(wǎng)站(重組成功的質(zhì)粒在選擇性培養(yǎng)基平板上呈現(xiàn)為白色菌落)。然后可以將重組Bacmid進行挑菌,小量提取分離并且轉(zhuǎn)染到昆蟲細胞,從而進行感染重組桿狀病毒顆粒生產(chǎn)。
高效DH10Ba感受態(tài)細胞的能夠有效抵抗連接酶和連接酶緩沖液,同時可以容忍少量未稀釋的連接反應(yīng)。 φ80dlacZDM15標(biāo)記可以利用Bacmid載體中的β-半乳糖苷酶基因α-互補使用含X-gal平板培養(yǎng)基的藍白斑菌落篩選。
綜上所述,DH10Bac感受態(tài)細胞本身含有卡那霉素和四環(huán)素抗性,而供體質(zhì)粒pFastbac含有慶大霉素的抗性,所以在制備DH10Bac感受態(tài)細胞時需要在培養(yǎng)時添加卡那霉素和四環(huán)素,而在制備桿粒時需要使用卡那霉素,四環(huán)素,慶大霉素的三抗平板。
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