Human VCAM-1/CD106 ELISA Kit

康朗生物的Human VCAM-1/CD106 ELISA Kit (Human Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Enzyme-Linked 
ImmunoSorbent Assay Kit)，即人血管細胞粘附分子-1酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測人血清、血漿、細胞或組織裂解液、或細胞培養(yǎng)上清液中的VCAM-1/CD106的ELISA試劑盒。
本產(chǎn)品檢測靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好。多次重復(fù)檢測結(jié)果表明，最小檢出量為26.5pg/ml，與人的E-Selectin、VCAM-1
、ICAM-2、ICAM-3，小鼠ICAM-1等均沒有交叉反應(yīng)，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
人血管細胞粘附分子(Vascular Cell Adhesion Molecule-1, VCAM-1)是一種分子量在100-110kDa之間，含有715個氨基酸的I型跨膜糖蛋白，具有7個C2型免疫球蛋白區(qū)域。VCAM-1具有674個氨基酸長度的胞外域、22個氨基酸長度的跨膜域和19個氨基酸長度的胞質(zhì)域。在胞外域中含有多個N連接糖基化位點。VCAM-1具有一定程度的種間同源性，小鼠和大鼠VCAM-1與人VCAM-1大約具有75%的氨基酸同源性。在人、小鼠和大鼠之間，具有19個氨基酸的胞質(zhì)域具有高度保守性。VCAM-1具有許多變體，這是由于基因選擇性剪切導(dǎo)致。表達VCAM-1的細胞主要有神經(jīng)元細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和巨噬細胞。
在細胞培養(yǎng)上清液、血液和腦脊液中都已經(jīng)檢測到了游離VCAM-1的存在。在體外，NIH-3T3細胞產(chǎn)生游離的VCAM-1一定程度上會依賴基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。VCAM-1主要與α4β1 (VLA-4)和α4β7 (LPAM-1)整合素結(jié)合，這兩種整合素在多種細胞上都有表達，例如VLA-4在除了中性粒細胞外的所有白細胞上都有表達。因此VCAM-1和受體的相互作用在白細胞的遷移等過程中起到重要作用。VCAM-1還能調(diào)節(jié)破骨細胞生成以及在低氧時誘導(dǎo)鐮狀細胞附著在血管內(nèi)皮細胞上。
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測樣品中人VCAM-1/CD106的濃度，其原理見圖1。人VCAM-1/CD106特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標板上，當(dāng)加入標準品或樣品時，其中的人VCAM-1/CD106會與捕獲抗體結(jié)合。當(dāng)加入生物素化的抗人VCAM-1/CD106抗體后，生物素化抗人VCAM-1/CD106抗體與人VCAM-1/CD106結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物。隨后加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin (HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結(jié)合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過氧化物酶就會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測450nm處的吸光度值就能實現(xiàn)定量檢測。人VCAM-1/CD106濃度與A450值呈正比，通過繪制標準曲線，對照樣品吸光度值，即可計算出樣品中人VCAM-1/CD106濃度。

圖1. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

一個包裝的本試劑盒，包括標準品檢測，可以進行96次檢測。
保存條件：
標準品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個月內(nèi)有效；試劑盒其它組分4℃保存6個月內(nèi)有效。除標準品外，試劑盒其它組分嚴禁凍存。
  注意事項：
由于標準品一般是凍干粉，在制備后需要嚴格校準，所以標準品的瓶數(shù)及每瓶標準品所需加入的稀釋液體積請以實際收到的試劑盒及標準品標簽上的標注為準。
洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
為保證標準品的精確性，標準品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
TMB溶液請勿接觸氧化劑和金屬，否則容易失效。
加樣時，請注意每個樣品或標準品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
由于本試劑盒均進過獨立測試，所以請勿混用不同貨號和不同批次的試劑盒組分，即使是同種試劑盒不同批次的試劑盒組分也不能混用。多個試劑盒同時檢測時，請獨立使用各個試劑盒中的試劑，請勿使用不同試劑盒中相同名稱的組分。
充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
本試劑盒很多操作在室溫進行，要求嚴格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。
洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
檢測標準品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。
加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1.樣品準備
a. 樣品的準備請按下列流程進行操作：
(a)細胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b)對于血清樣品，將全血在室溫下放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c)對于血漿樣品，采集的全血建議使用EDTA進行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d)若待測樣品不能及時檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復(fù)凍融。
b.血清樣品不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑。
c.樣品應(yīng)清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。
d.請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結(jié)果將不準確。
注：血清或血漿樣品可能需要用1X標準品稀釋液適當(dāng)稀釋后再檢測。
2.檢測前準備工作
a.試劑盒從冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25-28℃)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。
b.配制適當(dāng)量的標準品稀釋液：將標準品稀釋液(5X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml標準品稀釋液(5X)加40ml水混勻后即為1X的標準品稀釋液。
c.配制適當(dāng)量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
d.按標準品標簽上標注的體積加入標準品稀釋液至1瓶標準品中，室溫孵育15分鐘(為確保標準曲線的準確性，切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標準品徹底溶解，使標準品終濃度達到1000pg/ml。通常每個濃度的標準品需要檢測2個孔，每個孔的標準品用量為100μl，共需200μl，同時稀釋時還需要使用250μl，因此如果1瓶標準品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標準品，并在合并混勻后使用。
e.取5個潔凈的1.5毫升離心管，每管預(yù)先加入250μl的標準品稀釋液，并參考圖2進行標準品的倍比稀釋，最終得到1000、500、250、125、62.5、31.25pg/ml共六個標準品濃度，最后將稀釋好的標準品依次加入預(yù)包被板孔中，標準品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個標準品濃度。

圖2. 標準品倍比稀釋示意圖。按標準品(STANDARD)標簽上標注體積加入標準品稀釋液溶解并混勻后的濃度為標準品的起始濃度。其它的倍比稀釋后的濃度依次為起始濃度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。

3.洗滌方法
自動洗板機或手工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣在厚吸水紙上適當(dāng)用力拍干。
4.實驗過程需自備的材料和儀器
a.不同規(guī)格的移液槍及相應(yīng)的吸頭
b.酶標儀
c.自動洗板機(如果沒有也可以手工洗板)
d.去離子水或雙蒸水
5.操作步驟
a.計算并確定一次實驗所需的預(yù)包被板條數(shù)，取出所需板條放置在96孔框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。
b.每次實驗都需配制標準品并繪制出標準曲線，同時建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔，設(shè)置方法為該孔只加TMB溶液和終止液。
c.分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl/孔加入相應(yīng)孔中，用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育120分鐘。對于血清或血漿樣品的VCAM-1的檢測，不同樣品稀釋比例有所區(qū)別，一般范圍在100-1000倍，如無明確范圍，建議從200倍開始稀釋，如果樣品濃度過高，超過檢測范圍，請加大稀釋倍數(shù)后重新稀釋檢測。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)。
注意：請先查閱相關(guān)文獻確定樣品中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標準品濃度，請適當(dāng)稀釋或濃縮后再進行檢測。
d.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
e.加入生物素化抗體100μl/孔(注：此生物素化抗體已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進行稀釋)。用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育60分鐘。
f.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
g.加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根過氧化物酶標記Streptavidin已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進行稀釋)。用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時(低于25℃)，需要適當(dāng)延長孵育時間。
h.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
i.加入顯色劑TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育15-20分鐘。室溫偏低時需要適當(dāng)延長孵育時間，此時可以孵育至標準品出現(xiàn)非常顯著的顏色變化，若樣品濃度足夠高也會出現(xiàn)顯著的顏色變化。
j.加入終止液50μl/孔，混勻后立即測量A450值。
6.結(jié)果分析
a.復(fù)孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔平均值可作為測量值。
b.每個標準品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。
c.繪制標準曲線。以標準品濃度為橫坐標，A450值為縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過樣品的吸光度值和標準曲線計算出樣品的相應(yīng)濃度。

圖3. Human VCAM-1/CD106 ELISA Kit的標準曲線。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

d.若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重新測定，計算濃度時需注意乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！