桔梗染料法PCR鑒定試劑盒
Radix platycodonis
它具有下列特點:
1. 即開即用,用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)桔梗保守序列設計的專一性引物,與相關(guān)病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測,避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
6. 本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷。
規(guī)格及成分
儲存條件:-20℃以下,有效期12個月。
使用方法:
一、樣品采集:
1、食品樣品:樣品的采集與預培養(yǎng)按照樣品的采集與預培養(yǎng)按照《食品衛(wèi)生微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗要求進行。
2、血液樣品:用無菌注射器抽取受檢者靜脈血2mL,注入無菌EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管,立即混勻。
3、糞便樣品:取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
4、病灶部位樣品:取發(fā)病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
一、稀釋 PCR 陽性對照(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)
1. 注意:由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
注:上述樣品建議經(jīng)過增菌后,收集培養(yǎng)物用于檢測。
二、DNA提取:
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液,按以下說明進行DNA核酸的粗提。也可采購上海澤葉生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品,并按照相應試劑盒說明進行操作。
1、液體培養(yǎng)物:取液體培養(yǎng)物100μL加到1.5mL無菌離心管中,8000rpm離心3min,盡量吸棄上清,加入50μL DNA抽提液充分混勻,100℃恒溫10min,13000rpm離心3min,取上清5μL進行PCR反應。
2、固體培養(yǎng)物:挑取單克隆菌落與50μL DNA抽提液充分混勻,100℃恒溫10min,13000rpm離心3min,取上清5μL進行PCR反應。
3、糞便樣品:挑取米粒大小糞便于滅菌離心管中,加入0.5mL生理鹽水,振蕩混勻,13000rpm離心3分鐘,棄上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻,100℃恒溫10min,13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
4、其他液體標本:取標本2-3mL,13000rpm離心3min,棄上清,沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻,100℃恒溫10min,13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
注:陽性對照和陰性對照為已經(jīng)抽提好的核酸(無需提取),直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高,建議最后在樣品制備區(qū)域加入陽性對照。
檢測步驟:
三、設置qPCR反應(20μL體系,在樣品制備室進行)
10. 如果只做1次重復,則標記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個
樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復,則反應設置數(shù)量相應增加2或3倍。
11. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):
第 7 步所得 PCR 陽性對照稀釋液(2-7 號)
各 6μL(2 號樣到
2 號管,3 號樣到 3
號管…)
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照,其他熒光PCR儀器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,則用水替代。
蓋上蓋子后上機,按下面參數(shù)進行PCR(具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化)。
2.qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團:設置為FAM
四、結(jié)果分析:
1.結(jié)果分析條件設定
直接讀取檢測結(jié)果。基線和閾值設定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整,以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。
2.試驗成立判定
1)陰性對照(NTC):不應產(chǎn)生任何的擴增曲線。
2)陽性對照(ESKZ -PTC):均產(chǎn)生擴增曲線,且Ct值≤35。
3)以上條件應同時滿足,否則,此次試驗視為無效。
3.結(jié)果判定
1)在試驗成立的條件下,Ct值≤35的樣本為陽性,表明阪崎腸桿菌核酸陽性。
2)Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本,表明阪崎腸桿菌核酸陰性。
3)如果35<Ct值≤40,判為可疑樣品。對于可疑樣品,先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數(shù)擴增曲線,則為可疑陽性,否則判為陰性。
4)對于可疑陽性樣品,重新抽提核酸,再次進行阪崎腸桿菌real time PCR檢測。如果重復擴增曲線為對數(shù)擴增曲線,判為樣本陽性,表明阪崎腸桿菌核酸陽性;否則判為樣本陰性。
五、注意事項:
1)初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
2)所有使用的離心管應高壓滅菌,而且必須不含DNA酶。
3)PCR操作應嚴格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)等),防止實驗室污染。
4)樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺進行,以免污染。
5)試劑盒里所有物品應視為污染物對待,按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
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