EMSA/Gel-Shift 試劑盒

EMSA/Gel-Shift試劑盒(EMSA/Gel-Shift Kit)是用于EMSA(也稱gel shift)研究的一個試劑盒。通過EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的結(jié)合情況，從而可以研究細(xì)胞內(nèi)一些轉(zhuǎn)錄因子的激活水平。本試劑盒提供了進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)的探針標(biāo)記、蛋白和DNA結(jié)合以及EMSA上樣等的主要試劑，使EMSA實(shí)驗(yàn)變得簡單方便。
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)中含有poly(dI-dC)等有效成分。其中poly(dI-dC)的濃度經(jīng)過優(yōu)化，可以很好的消除蛋白和標(biāo)記探針間的非特異性結(jié)合，同時又不會減弱目的轉(zhuǎn)錄因子和標(biāo)記探針間的結(jié)合。
每個EMSA/Gel-Shift試劑盒足夠標(biāo)記10-20次探針，足夠進(jìn)行100個蛋白和探針的結(jié)合反應(yīng)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。
注意事項(xiàng)：
需自備待標(biāo)記的EMSA探針，需自備用于探針標(biāo)記的同位素，需自備EMSA膠配制的相關(guān)試劑。
細(xì)胞核蛋白的抽提可以使用碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(P0028)。 
如需做super-shift，需自備用于super-shift的抗體。
本實(shí)驗(yàn)涉及到同位素的操作，請嚴(yán)格按照同位素的相關(guān)管理?xiàng)l例進(jìn)行操作。 
      本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 
使用說明：
1. 探針的標(biāo)記：
(1)如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：

按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4Polynucleotide　Kinase，混勻。

(2)使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。
(3)加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。
(4)再加入89微升TE，混勻。此時可以取少量探針用于檢測標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo)記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡便起見，通常不必測定探針的標(biāo)記效率。

(5)標(biāo)記好的探針立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。

2. 探針的純化：
通常為實(shí)驗(yàn)簡便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如下步驟操作：

(1)對于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。

(2)在-70℃至-80℃沉淀1小時，或在-20℃沉淀過夜。
(3)在4℃，12,000g-16,000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉淀。
(4)在4℃，12,000g-16,000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。

(5)加入100微升TE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。

3. EMSA膠的配制：
(1)準(zhǔn)備好倒膠的模具。可以使用常規(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞摺＿x擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大EMSA膠的模具。

(2)按照如下配方配制20毫升4％的聚凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大)。

(3)按照上述次序加入各個溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡，并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。

4. EMSA結(jié)合反應(yīng)：
(1)如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)(預(yù)期的結(jié)果參見圖1)：

(2)按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫（20-25℃）放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。

(3)加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。

注意：有些時候溴酚藍(lán)會影響蛋白和DNA的結(jié)合，建議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。

5. 電泳分析：
(1)用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。

(2)把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。

(3)按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。

(4)剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。

(5)在干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測。EMSA的典型分析結(jié)果可以參見下面的圖1。

  圖1.一個典型的EMSA/Gel-Shift分析圖 
1,陰性對照反應(yīng)(標(biāo)記探針)；

2，常規(guī)反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針)；

3,探針冷競爭反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針+標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記探針)；

4,突變探針的冷競爭反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針+標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記突變探針)；

5,Super-shift反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針+目的轉(zhuǎn)錄因子的特異抗體)。