PCR Kit with Taq
本PCR試劑盒帶有Taq DNA Polymerase、PCR buffer、dNTP和上樣緩沖液，自備模板和引物即可進行PCR反應(yīng)，適合用于普通的PCR或RT-PCR定性或定量檢測，也可以用于不太長的的DNA片段的克隆。
Taq DNA Polymerase簡稱Taq酶或Taq，是最常用的DNA聚合酶之一。
Taq DNA Polymerase是一種來源于嗜熱菌Thermus aquaticus的高度熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，95℃孵育時的半衰期大于40分鐘。Taq酶的分子量為94kDa。Taq酶可以催化5'至3'方向的依賴于DNA模板的脫氧核苷酸的聚合。Taq酶沒有3'至5'的外切酶活性，有非常低的5'至3'外切酶活性。由于Taq酶沒有3'至5'的外切酶活性，因此在DNA聚合過程中相當于核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用，最終會導致PCR產(chǎn)物的3'末端會產(chǎn)生3'-dA overhangs，即產(chǎn)生帶一個A的3'粘端。本Taq DNA Polymerase為recombinant Taq DNA Polymerase，通過大腸桿菌表達純化獲得，和純化獲得的天然Taq DNA Polymerase在各方面的性質(zhì)相同。
活性定義：One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10 nmol of deoxyribonucleotides into a
polynucleotide fraction(adsorbed on DE-81) in 30 min at 70℃. Enzyme activity is assayed in the following mixture: 67 mM Tris-HCl(pH 8.8 at 25℃), 6.7 mM MgCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA, 0.75 mM activated calf thymus DNA, 0.2 mM of each dNTP, 0.4 MBq/ml [3H]dTTP。
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)PCR反應(yīng)要求。
酶儲存溶液：20 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.5% (v/v) Nonidet P40, 0.5% (v/v)
Tween 20 and 50% (v/v) glycerol。
10X PCR Buffer(with Mg2+)：100 mM Tris-HCl(pH 8.8 at 25℃), 500 mM KCl, 15mM MgCl2, 0.8% (v/v) Nonidet
P40。
失活或抑制：酚氯仿抽提可以使Taq酶失活，加入脫氧膽酸鈉至0.06%，SDS至0.01%，或sarkosyl至0.02%均可以抑制Taq酶。
試劑盒帶有dNTP，該dNTP為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物，每種的濃度均為2.5mM。
本試劑盒用于50微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于160個反應(yīng)，用于20微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于400個反應(yīng)。
包裝清單：
XY-7232-1
Taq DNA Polymerase(5U/μl)
200U
XY-7232-2
10X PCR Buffer(with Mg2+)
1ml
XY-7232-3
dNTP(2.5mM each)
0.7ml
XY-7232-4
6X DNA Loading Buffer
1ml
保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏可以擴增目的基因序列超過1000萬倍，在使用Taq酶時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。
Taq DNA polymerase在PCR過程中每循環(huán)的出錯幾率約為2.2×10-5，對于大于1kb的DNA片段的克隆推薦使用出錯幾率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、BeyoTaq DNA polymerase等。對于普通的PCR或RT-PCR定性檢測或定量檢測，Taq DNA polymerase是選擇。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
a.溶解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將Taq DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)(如果有多個類似的PCR反應(yīng)，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和Taq酶的混合物，然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況，有時混合物中可以包括引物)：
雙蒸水或Milli-Q水
-
(36.75-x)μl
(14.7-y)μl
10X PCR Buffer (with Mg2+)
1X
5μl
2μl
dNTP (2.5mM each)
0.2mM each
4μl
1.6μl
引物混合物(10μMeach)
0.8μM
4μl
1.6μl
Taq DNA Polymerase (5U/μl)
1.25U/50μl
0.25μl
0.1μl
*對于不同類型的模板在50μl反應(yīng)體積中推薦用量如下：
哺乳動物基因組DNA：0.1-1μg；大腸桿菌基因組DNA：10-100ng；質(zhì)粒DNA：0.1-10ng。
過多的模板DNA容易導致非特異性的PCR產(chǎn)物。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil，ST275)。
e.各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
STEP1(起始變性): 94℃ 3min
STEP2(變性): 94℃ 30sec
STEP3(退火): 55℃ 30sec
STEP4(延伸): 72℃ 1min
STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles
STEP6(最終延伸): 72℃ 10min
STEP7(臨時保存): 4℃ forever
a.PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件包括溫度、時間和循環(huán)數(shù)等。
b.STEP4(延伸)的時間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度進行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時間為1分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長度為1kb，則延伸時間可以設(shè)置為1分鐘，PCR產(chǎn)物的長度為2kb，則延伸時間可以設(shè)置為2分鐘，以此類推。
c.對于初次進行的PCR，為盡量確?？梢詳U增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對于需進行半定量或定量的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進行適當優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達到平臺期。
常見問題：
1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
a.引物設(shè)計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當?shù)囊镌O(shè)計軟件進行引物設(shè)計，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
b.待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
c.長片段擴增。盡管Taq DNA polymerase可以擴增最長達8kb的DNA片段，但大多數(shù)時候比較適合擴增3kb以下的片段，更長片段的擴增推薦使用其它更適合長片段擴增的DNA聚合酶。
d.PCR反應(yīng)設(shè)置時在室溫進行容易導致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
e.由于引物存在一定的二級結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
f.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
g.延伸時間不足。可按照每1kb片段延伸1分鐘進行設(shè)置，對于較難擴增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸1.5-2分鐘。
h.待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。可以調(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃2-4min。
i.在不同PCR儀上進行PCR反應(yīng)，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
j.循環(huán)數(shù)不足，適當延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
k.模板含量太低，適當加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計一對PCR引物，然后對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，這樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從次PCR產(chǎn)物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不能去除非特異性條帶。
l.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
m.當產(chǎn)生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。
n.注意設(shè)置適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ泻艽髱椭?/p>
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