HemoTaq™ HF DNA Polymerase (Blood-resistant)

信裕生物生產(chǎn)的HemoTaq™ HF DNA Polymerase (Blood-resistant)，即耐血HemoTaq™高保真(high-fildelity) DNA聚合酶，是一種經(jīng)過基因工程改造的非常高效的并且具有高保真性的適用于EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝血樣品或干血斑樣品直接PCR檢測的耐熱DNA聚合酶。
對于全血樣品可以直接PCR檢測，無須提取DNA。本產(chǎn)品對人、小鼠等全血中血紅素等各種PCR抑制劑表現(xiàn)出超強的抗性，對于新鮮采集的、4℃保存或低溫凍存EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝的人或小鼠血液樣品或者干血斑(如whatman903或FTA采血卡上的干血斑)，都無需進行DNA提取純化，可以直接用于PCR擴增目的DNA。
所需血樣少，耐血能力高。本產(chǎn)品用于20μl的PCR擴增體系時，通常僅加入約1μl抗凝全血即可順利完成PCR檢測。用于檢測細菌、病毒等微生物感染時，為獲得最高的檢測靈敏度，20μl的PCR擴增體系中加入的血液量可以達到4μl，即20%體積，有些類型的抗凝血(例如人肝素抗凝血)加入的全血體積可以達到10μl，即50%體積。
兼容EDTA、肝素或檸檬酸鈉三種常見抗凝血。血液樣品用于PCR檢測時，EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝血都可以兼容的。如果希望取得的檢測效果，優(yōu)先推薦EDTA抗凝血。因為EDTA可以螯合多種核酸酶發(fā)揮酶活性所必須的金屬離子，從而可以更好地抑制核酸的降解。
本產(chǎn)品提供了一對陽性對照引物，便于確認PCR檢測效果。該對引物是一種人和小鼠的通用引物，可以擴增人或小鼠基因組DNA中β-actin基因的300bp DNA片段。
本產(chǎn)品的耐血體積百分比可以達到20-50%。本產(chǎn)品用于肝素、檸檬酸鈉和EDTA抗凝血PCR檢測的效果參考圖1。圖中可見，本產(chǎn)品對肝素(heparin)、檸檬酸鈉和EDTA處理的人全血的耐受體積百分比可以達到50%、20%和40%。對于小鼠全血的PCR檢測，本產(chǎn)品可以耐受的體積百分比也不小于20%。綜上，本產(chǎn)品用于PCR檢測時，推薦的全血的使用量為PCR總體積的1-20%，先的推薦用量為5-10%。
圖1. 信裕生物生產(chǎn)的HemoTaq™ HF DNA Polymerase擴增圖中所示不同抗凝劑采集的人抗凝全血中目的基因的檢測效果圖。使用HemoTaq™ HF DNA Polymerase及本產(chǎn)品提供的Control primer mix，在PCR體系中直接加入不同體積百分比的不同抗凝劑采集的人抗凝血，用于擴增β-actin基因的300bp DNA片段后的電泳效果圖。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。
HemoTaq™ HF DNA Polymerase (Blood-resistant)的保真性高于Pfu DNA Polymerase (D7216/D7217)，和更高保真性的BeyoFusion™ DNA Polymerase (D7220/D7221)的保真性相近。因此本產(chǎn)品不僅可以用于血液檢測目的，也可以用于PCR擴增并克隆特定基因。
本產(chǎn)品可以輕松擴增5kb或更長的目的片段。本產(chǎn)品擴增不同長度目的基因的效果參考圖2。圖中可見，HemoTaq™ HF DNA Polymerase以檸檬酸鈉抗凝全血為模板可以直接PCR擴增出5kb或更長的DNA片段。
圖2. 信裕生物生產(chǎn)的HemoTaq™ HF DNA Polymerase直接以10%檸檬酸鈉抗凝全血為模板擴增不同長度的目的基因的效果圖。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands)); 1, β-actin (300bp); 2, CCR5 (630bp); 3, CCR5 (1100bp); 4, CCR5 (2000bp); 5, IL-6 (2841bp); 6, IL-6 (4171bp); 7, IL-6 (4882bp)。
本產(chǎn)品擴增獲得的PCR產(chǎn)物為平末端，不能直接用于和T載體連接進行TA克隆。
來源：大腸桿菌重組表達純化獲得。
用途：抗凝血樣品基因組DNA中目的基因的直接擴增、基因分型(如基因缺失等)、血液樣品中細菌、病毒等微生物感染的基因檢測，以及基因敲除或轉(zhuǎn)基因小鼠基因型分析。本產(chǎn)品和D7241 HemoTaq™ DNA Polymerase相比，由于保真性更高，更適合用于血液樣品中目的基因的擴增和克隆。
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)PCR反應(yīng)要求。
酶儲存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.5% (v/v) Nonidet P40, 0.5% (v/v) Tween 20 and 50% (v/v) glycerol。
失活或抑制：酚氯仿抽提可以使HemoTaq™ HF DNA Polymerase失活。
本產(chǎn)品如果用于50微升的PCR反應(yīng)體系，兩種包裝的本產(chǎn)品分別足夠用于80個和400個反應(yīng)；如果用于20微升的PCR反應(yīng)體系，兩種包裝的本產(chǎn)品分別足夠用于200個和1000個反應(yīng)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏，在使用HemoTaq™ HF DNA Polymerase時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。
設(shè)置PCR反應(yīng)體系時，抗凝血的推薦用量為PCR體系總體積的5%左右，可以直接添加到PCR體系中，無需進行任何額外處理。
PCR反應(yīng)結(jié)束之后，建議3000-5000g離心3-5min以沉淀血細胞碎片，便于吸取上清用于電泳分析等。注意：由于抗凝血本身的原因，PCR結(jié)束后在PCR管底部會出現(xiàn)透明凝膠狀物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象。
需自備dNTP和Nuclease-Free Water。推薦選購信裕生物生產(chǎn)的D7371 dNTP Mixture (2.5mM each)或D7373 dNTP Mixture (25mM each)，以及ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
a.融解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將HemoTaq™ HF DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系(如果有多個類似的PCR反應(yīng)，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和HemoTaq™ HF酶的混合物，然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況，有時混合物中也可以包括引物)：

注意：
(a)模板使用量：作為PCR模板的抗凝血用量一般為PCR反應(yīng)體系總體積的1-20%，建議起始使用量為5%。如果PCR反應(yīng)用于檢測基因組的DNA片段，可以適當減少抗凝血用量；如果用于檢測血液樣品中某種病毒或細菌等微生物的目的DNA片段，建議使用50μl的PCR體系，并使用較大的模板血量。對于高GC含量的PCR擴增，可以使用擴增高GC含量DNA片段的D7245 Blood PCR Enhancer (2X)，或者嘗試向PCR體系中加入終濃度1-10% (體積百分比)的DMSO。對于干血斑樣品，20μl和50μl的PCR體系中分別推薦使用約0.8平方毫米和2平方毫米的干血斑。
(b)引物濃度：通常引物的終濃度為0.5μM時可獲得良好的檢測效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil (礦物油))。
e.把設(shè)置好的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下表格：

注意：
a.起始變性(94℃，5min)可以使白細胞裂解，釋放出可用于PCR擴增的基因組DNA。
b.需根據(jù)每次反應(yīng)的模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等適當優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，包括溫度、時間和循環(huán)數(shù)等。
c.對于初次進行的PCR，為盡量確保可以擴增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。用于目的基因擴增和考慮，循環(huán)數(shù)通常為30-35，如果用于微量微生物感染的檢測，循環(huán)數(shù)可以嘗試設(shè)置為35-40。

常見問題：
1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
a.引物設(shè)計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當?shù)囊镌O(shè)計軟件進行引物設(shè)計，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
b.待擴增片段GC含量偏高。向PCR體系中加入適合擴增高GC含量DNA片段的D7245 Blood PCR Enhancer (2X)，并相應(yīng)地根據(jù)其要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
c.目的片段過長。盡管HemoTaq™ HF DNA Polymerase可以擴增最長達5kb的DNA片段，但大多數(shù)時候更適合擴增2-3kb以下的片段。對于過長的目的片段的擴增，需要適當優(yōu)化引物和PCR反應(yīng)參數(shù)。
d.引物的二級結(jié)構(gòu)、引物二聚體或引物偏短會導(dǎo)致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
e.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
f.延伸時間不足。可按照每1kb片段延伸15秒進行設(shè)置，對于較難擴增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸30-60秒。
g.在不同PCR儀上進行PCR反應(yīng)，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
h.循環(huán)數(shù)不足，適當延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為30-40。
i.模板用量偏少，可以在耐血體積范圍內(nèi)適當加大樣品用量，或采用巢式PCR (nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計一對PCR引物，然后對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，這樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從次PCR產(chǎn)物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不能去除非特異性條帶。
j.對PCR引物進行脫鹽甚至PAGE膠或HPLC純化。
k.使用高質(zhì)量的dNTP混合物。
l.適當增加HemoTaq™ HF DNA polymerase的用量。
m.當產(chǎn)生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。
n.注意設(shè)置適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔτ趯嶒灲Y(jié)果的判斷有很大幫助。
o.確保沒有漏加任何PCR組分。
2.雜帶較多或條帶彌散
a.退火溫度提高2-5℃。
b.減少抗凝全血的用量。
c.在室溫配制PCR體系容易產(chǎn)生非特異性條帶。推薦在冰浴上配制PCR反應(yīng)體系。
d.適當減少HemoTaq™ HF DNA Polymerase的用量，加入適合擴增高GC含量DNA片段的D7245 Blood PCR Enhancer (2X)。
e.適當縮短延伸時間。