BeyoRT™ III cDNA合成預混液(5X) (with gDNA EZeraser)

信裕生物生產(chǎn)的BeyoRT™ III cDNA合成預混液(5X)，即BeyoRT™ III First Strand cDNA Synthesis Master Mix (5X) (with gDNA EZeraser)，是一種僅需加入RNA模板和水就能進行反轉(zhuǎn)錄的最簡單、便捷、快速、穩(wěn)定、高效并且能有效避免基因組DNA (genomic DNA, gDNA)干擾的的cDNA鏈合成產(chǎn)品。本產(chǎn)品對于3kb以下片段，10min就能完成反轉(zhuǎn)錄；產(chǎn)物長度可以長達12kb；可以在55℃進行高溫反轉(zhuǎn)錄，有效解決復雜二級結(jié)構RNA反轉(zhuǎn)錄難的問題；-20℃不會結(jié)凍，取用非常便捷。
BeyoRT™ III cDNA合成預混液(5X) (with gDNA EZeraser)包含了經(jīng)過改造和優(yōu)化的快速高效(短至10min完成反轉(zhuǎn)錄)、熱穩(wěn)定(高達55℃)、高精確度、產(chǎn)物超長(長達12kb)的BeyoRT™ III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase Inhibitor、Oligo(dT)₁₈ Primer、Random Hexamer Primer、dNTPs、MgCl₂、反轉(zhuǎn)錄反應緩沖液能去除基因組DNA污染的gDNA EZeraser，只需加入RNA模板和水(DEPC-treated Water或DNase/RNase-Free Water)就能進行反轉(zhuǎn)錄反應，大大簡化了反轉(zhuǎn)錄的實驗操作，使操作最為便捷，能有效避免常規(guī)反轉(zhuǎn)錄非常復雜的操作過程中可能導致的操作誤差、孔間污染等，使反轉(zhuǎn)錄的重復性和平行性大幅提升。
本產(chǎn)品可廣泛用于獲得總RNA或mRNA后cDNA條鏈的合成，后續(xù)可以用于PCR、real-time PCR也稱定量PCR (quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二鏈合成以及cDNA文庫的構建，尤其是反轉(zhuǎn)錄所得目的基因的克隆等。BeyoRT™ III cDNA鏈合成預混液(5X)還可以通過反轉(zhuǎn)錄用于DNA探針的熒光、生物素辛或同位素標記等，也可以通過引物延伸(primer extension)來分析和研究RNA。
本產(chǎn)品中的gDNA EZeraser其主要有效成分為熱敏性dsDNase (Thermolabile dsDNAse)，能特異性地降解雙鏈基因組DNA，效率高，作用時間短，在充分去除殘留基因組DNA之后不會對cDNA造成顯著影響。熱敏性dsDNase在55℃加熱5min就能導致完全失去酶活性。后續(xù)如果用于常規(guī)PCR或qPCR，PCR的首次變性條件能充分失活gDNA EZeraser，因此不必擔心gDNA EZeraser對于后續(xù)的常規(guī)PCR或qPCR的干擾。使用本產(chǎn)品可以有效避免總RNA中的gDNA對于后續(xù)qPCR定量的干擾。另一方面，也有助于簡化qPCR引物設計，無需進行跨內(nèi)含子引物設計。
BeyoRT™ III cDNA合成預混液(5X) (with gDNA EZeraser)中的BeyoRT™ III M-MLV reverse transcriptase，是一種經(jīng)過改造和優(yōu)化的快速高效(短至10min完成反轉(zhuǎn)錄)、熱穩(wěn)定(高達55℃)、高精確度、產(chǎn)物超長(長達12kb)的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，具有正常的依賴于RNA或DNA模板的DNA聚合酶活性，能夠以RNA或DNA為模板，在引物存在的情況下進行互補DNA鏈的合成，即可以進行cDNA(complementary DNA)的鏈合成，同時它保留了RNase H的活力，能選擇性剪切RNA和DNA雜合雙鏈中的RNA，有利于后續(xù)cDNA第二鏈的合成。
BeyoRT™ III cDNA合成預混液(5X) (with gDNA EZeraser)的反轉(zhuǎn)錄效率與非預混液的反轉(zhuǎn)錄效率一致(參考圖1)。

圖1. 使用信裕生物的BeyoRT™ III cDNA合成預混液(5X) (with gDNA EZeraser)和使用BeyoRT™ III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的常規(guī)反轉(zhuǎn)錄體系的效果對比圖。在20μl的反轉(zhuǎn)錄反應體系中，以HEK293T細胞中提取的1µg總RNA為模板，沒有加入反轉(zhuǎn)錄酶、分別使用BeyoRT™ III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的常規(guī)反轉(zhuǎn)錄體系和BeyoRT™ III cDNA合成預混液(5X) (with gDNA EZeraser)，42℃反轉(zhuǎn)錄60min。然后取1μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別進行兩個目的基因(3.0kb的Fibrillin1基因和6.0kb的ADAR1基因)的PCR擴增和電泳檢測。

如果希望進行常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄操作，可以單獨選購BeyoRT™ III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(D7176),RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373)，或者選購BeyoRT™ III cDNA鏈合成試劑盒(D7178)進行反轉(zhuǎn)錄反應。
本產(chǎn)品經(jīng)測試可以輕松完成長度為8 kb及以下基因的反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的長度可以達到12 kb。BeyoRT™ III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性好，反轉(zhuǎn)錄效率高。本產(chǎn)品最適反應溫度為42℃，當溫度達到50℃時仍具有很高活性，對于長度較短的cDNA反轉(zhuǎn)錄，溫度達到55℃時也可獲得較高產(chǎn)量的cDNA。高溫反轉(zhuǎn)錄對于高GC含量RNA的反轉(zhuǎn)錄，能有效減少二級結(jié)構，提升反轉(zhuǎn)錄效率。本產(chǎn)品反轉(zhuǎn)錄速度快，6kb以下的cDNA反轉(zhuǎn)錄只需0.5h即可完成，3kb以下的cDNA反轉(zhuǎn)錄10min即可完成。
本產(chǎn)品操作便捷，作為即用型鏈合成預混液(5X)，即反轉(zhuǎn)錄預混液(5X)，只需加入模板RNA和水，即可快速進行反轉(zhuǎn)錄反應，并且BeyoRT™ III cDNA合成預混液(5X) (with gDNA EZeraser)在-20℃不會結(jié)凍，使用非常便捷。
本產(chǎn)品重復性好，反轉(zhuǎn)錄所有試劑預混合，大大減少操作步驟，有效降低污染幾率和操作誤差，使實驗結(jié)果更加一致，重復性更好。
失活或抑制：80℃孵育10min可以導致本產(chǎn)品中的BeyoRT™ III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶失活；EDTA、EGTA等螯合劑、無機磷酸鹽或焦磷酸鹽以及聚氨(polyamine)對BeyoRT™ III M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶有抑制作用。55℃孵育5min可以導致本產(chǎn)品中的gDNA EZeraser失活。
本試劑盒的不同包裝分別足夠進行20次、100次和500次反轉(zhuǎn)錄反應。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
對于GC含量比較高的RNA的反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)品的使用說明中給予了特別說明，請予以關注。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1. cDNA條鏈的合成(First-stand cDNA Synthesis)：
a. 參考如下表格中設置的20μl反轉(zhuǎn)錄體系：

*To 16μl表示加入DEPC-treated Water至最終體積為16μl。
b. 輕輕混勻(用移液器輕輕吹打混勻或用渦旋混合器在最低速度輕輕混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 42℃孵育10-60min。反轉(zhuǎn)錄3kb以下的cDNA，反轉(zhuǎn)錄10min即可，反轉(zhuǎn)錄3-6kb的cDNA，反轉(zhuǎn)錄30min即可，而6kb以上的cDNA推薦反轉(zhuǎn)錄60min。后續(xù)用于qPCR時，檢測任何長度的基因，通常反轉(zhuǎn)錄10min就足夠了。注意：對于GC含量較高或二級結(jié)構比較嚴重的模板RNA，可以50℃反轉(zhuǎn)錄60 min，以充分利用本產(chǎn)品反轉(zhuǎn)錄酶在50℃時仍有良好的反轉(zhuǎn)錄酶活性這一特點，在較高溫度進行反轉(zhuǎn)錄可以有效減少二級結(jié)構的干擾。如果擬在50℃或更高溫度進行反轉(zhuǎn)錄，推薦先在37℃孵育2min以充分去除基因組DNA污染，然后再在50℃或更高溫度進行反轉(zhuǎn)錄，因為50℃或更高溫度會導致gDNA EZeraser快速失活。
d. 80℃孵育10 min以失活反轉(zhuǎn)錄酶并終止反轉(zhuǎn)錄反應。說明：對于5kb以上的長片斷cDNA不推薦采用加熱的方法失活反轉(zhuǎn)錄酶，該方法易導致部分長片斷DNA被剪切，此時可考慮酚氯仿抽提或柱純化方法。
e. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以直接用于后續(xù)的PCR反應等，也可以-20℃凍存以備以后使用。用于后續(xù)PCR反應時，如果PCR的反應體系為20μl和50μl，則推薦相應地使用0.8μl和2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
2. 引物延伸、探針標記等其它用途請自行參考M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的相關文獻資料進行。

常見問題：
1. 總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳觀察不到。
a. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由于是從模板反轉(zhuǎn)錄而獲得，而模板的量本身比較低，反轉(zhuǎn)錄的量通常還要少于模板量，并且總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小很不均勻，因此通?？俁NA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接電泳觀察是觀察不到的。
2. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過PCR擴增沒有特異性條帶。
a. PCR擴增沒有獲得特異性條帶時建議先使用actin、GAPDH等作為內(nèi)參進行PCR擴增，看是否可以成功擴增。如果可以成功，則說明PCR擴增體系沒有問題，此時通常是目的基因的引物設計欠佳，當然也有可能是反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。如果內(nèi)參不能被很好地擴增，則有可能PCR體系存在問題或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。
b. 模板RNA發(fā)生了降解。哺乳動物細胞或組織的總RNA瓊脂糖電泳后應該可以看到清晰的18S和28S rRNA條帶，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例應該大于等于2.0。如果比例小于2.0，則提示總RNA發(fā)生了顯著的降解，能重新制備總RNA樣品。避免RNA降解的主要方法是，嚴格進行RNA的相關操作，包括帶潔凈手套、戴一次性口罩、在潔凈環(huán)境中抽提或制備RNA，以盡量避免RNase污染。
c. 模板RNA的純度偏低。在提取純化RNA的過程中，殘留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍鹽、磷酸、焦磷酸、多胺、亞精胺等會抑制反轉(zhuǎn)錄酶活性。對RNA樣品進行柱純化，或者進行沉淀、洗滌和再溶解，通常可以有效去除殘留的污染物。通常選擇使用信裕生物的BeyoZol或Trizol抽提獲得的總RNA完全可以滿足反轉(zhuǎn)錄反應的需要。
d. 反轉(zhuǎn)錄反應的模板量不足。在抽提獲得總RNA后，在進行一些精細的定量檢測時通常會進行DNase I消化，以充分去除可能的殘留的DNA的干擾。DNase I進行熱失活時，需要加入EDTA至終濃度為2.5mM，否則RNA在沒有螯合劑的情況下，在加熱過程中容易被水解，從而導致模板量不足。此外，擴增特定基因時，需要先查詢該基因的組織分布特點，利用其高表達的組織進行目的基因的反轉(zhuǎn)錄和克隆。用該基因豐度極低的組織或細胞樣品進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，通常會由于模板量過少而PCR擴增失敗。
e. 如果RNA模板富含GC或容易形成二級結(jié)構，此時可以考慮把反轉(zhuǎn)錄溫度提高到45-55℃。