Hot-Start Taq DNA Polymerase
信裕生物生產(chǎn)的Hot-Start Taq DNA Polymerase是一種僅當(dāng)溫度高于45℃時(shí)才具有DNA聚合酶活性的Taq DNA Polymerase(簡(jiǎn)稱Taq酶)與其可逆抑制劑的混合物，俗稱熱啟動(dòng)Taq酶或HS Taq酶。使用本產(chǎn)品進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)可以在室溫操作，并能有效避免室溫操作時(shí)由于普通Taq酶或其它耐熱DNA聚合酶存在活性而導(dǎo)致的非特異性PCR背景。
信裕生物的Hot-Start Taq DNA Polymerase是Taq酶與其可逆性抑制劑的混合物。該抑制劑可以可逆性地結(jié)合于Taq酶活性位點(diǎn)，當(dāng)溫度低于45℃時(shí)，形成非活性的Taq酶和抑制劑的復(fù)合物，從而抑制了Taq酶的活性。在常規(guī)PCR反應(yīng)過(guò)程中，當(dāng)溫度升高至45℃或以上時(shí)，Taq酶和其可逆性抑制劑解離，從而發(fā)揮其正常的DNA聚合酶活性。上述機(jī)制使Hot-Start Taq DNA
Polymerase僅在加熱到45℃或以上時(shí)才會(huì)有酶活性，從而確保了小于45℃時(shí)不會(huì)發(fā)生非特異性的DNA聚合反應(yīng)，有效降低了PCR的非特異性背景，提高了PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性和精確性。
常規(guī)的DNA分離純化操作，例如PCR純化試劑盒或DNA凝膠回收試劑盒和乙醇沉淀等操作，都能有效去除本產(chǎn)品中的抑制劑，以避免可能的對(duì)于后續(xù)反應(yīng)的干擾。
Hot-Start Taq DNA Polymerase使用時(shí)無(wú)需額外的高溫孵育步驟以釋放Taq酶活性。
Hot-Start Taq DNA Polymerase和普通的Taq DNA Polymerase一樣，可以催化5'至3'方向的依賴于DNA模板的DNA的聚合反應(yīng)，沒(méi)有3'至5'的外切酶活性，最終會(huì)導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的3'末端產(chǎn)生3'-dA overhangs，即產(chǎn)生帶一個(gè)A的3'粘端，可直接用于TA克隆。
圖1. Hot-Start Taq DNA Polymerase的酶活力測(cè)定。A. Hot-Start Taq DNA Polymerase (HS Taq)在40℃時(shí)，其聚合酶活力完全被抑制。以M13 mp18 ssDNA (7249nt，電泳顯示約2.2kb)為模板，添加適量引物后40℃孵育10min，1% Agarose凝膠電泳。圖中可見普通Taq酶在40℃可以發(fā)生聚合反應(yīng)，使DNA條帶延長(zhǎng)至電泳呈現(xiàn)的約3.5kb大小，而Hot-Start Taq酶(HS Taq)完全不能使M13 mp18 ssDNA的鏈發(fā)生延長(zhǎng)，即其酶活力完全被抑制。B. Hot-Start Taq DNA Polymerase在常規(guī)PCR條件下其活力完全被釋放，PCR擴(kuò)增效果和Taq酶完全一致。
來(lái)源：本產(chǎn)品使用的Taq DNA Polymerase為recombinant Taq DNA Polymerase，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)純化獲得，和純化獲得的天然Taq DNA Polymerase在各方面的性質(zhì)相同。
用途：高背景和有非特異性條帶的PCR，高專一性PCR(high-specificity PCR)，高靈敏度PCR，生物芯片分析(microarray
analysis)，常規(guī)PCR，克隆PCR、TA克隆等，不建議用于熒光定量PCR (qPCR)。
活性定義：One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10 nmol of deoxyribonucleotides into a
polynucleotide fraction (adsorbed on DE-81) in 30 min at 70℃. Enzyme activity is assayed in the following mixture: 67
mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 6.7 mM MgCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA, 0.75 mM
activated calf thymus DNA, 0.2 mM of each dNTP, 0.4 MBq/ml [3H]dTTP。
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)PCR反應(yīng)要求。
酶儲(chǔ)存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.5% (v/v) Nonidet P40, 0.5% (v/v)
Tween 20 and 50% (v/v) glycerol。
10X Hot-Start PCR Buffer：100 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 500 mM KCl, 15mM MgCl2, 0.8% (v/v) Nonidet
P40。
失活或抑制：酚氯仿抽提可以使Hot-Start Taq DNA Polymerase失活，加入脫氧膽酸鈉至0.06%，SDS至0.01%，或
sarkosyl至0.02%均可以抑制Hot-Start Taq DNA Polymerase。
本產(chǎn)品用于50微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于160個(gè)反應(yīng)；用于20微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于400個(gè)反應(yīng)。
包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào)
產(chǎn)品名稱
包裝
XY-7211S-1
Hot-Start Taq DNA Polymerase (2.5U/μl)
200U
XY-7211S-2
10X Hot-Start PCR Buffer
1ml
保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏可以擴(kuò)增目的基因序列超過(guò)1000萬(wàn)倍，在使用Hot-Start Taq Polymerase時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
Hot-Start Taq DNA Polymerase在PCR過(guò)程中每循環(huán)的出錯(cuò)幾率約為2.2×10-5，對(duì)于大于1kb的DNA片段的克隆推薦使用出錯(cuò)幾率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA Polymerase、BeyoTaq DNA Polymerase等。對(duì)于普通的PCR或RT-PCR定性檢測(cè)或定量檢測(cè)，Hot-Start Taq DNA Polymerase是選擇。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
- 1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
- a.融解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將Hot-Start Taq DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
- b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系(如果有多個(gè)類似的PCR反應(yīng)，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和Hot-Start Taq酶的混合物，然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況，有時(shí)混合物中可以包括引物)：
雙蒸水或Milli-Q水
-
(36.5-x)μl
10X Hot-Start PCR Buffer
1X
5μl
dNTP (2.5mM each)
0.2mM each
4μl
引物混合物(10μM each)
0.8μM
4μl
Hot-Start Taq DNA Polymerase (2.5U/μl)
1.25U/50μl
0.5μl
- 注意：(a)通常引物的終濃度為0.2μM時(shí)可獲得良好的檢測(cè)效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度。
- (b)對(duì)于不同類型的模板在50μl反應(yīng)體積中推薦用量如下：哺乳動(dòng)物基因組DNA：0.1-1μg；大腸桿菌基因組DNA：10-100ng；質(zhì)粒DNA：0.1-10ng。過(guò)多的模板DNA容易導(dǎo)致非特異性的PCR產(chǎn)物。
- c. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
- d. 如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒(méi)有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil，ST275)。
- e. 把設(shè)置好的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
- 2. PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
- STEP1(起始變性): 94℃ 3min
- STEP2(變性): 94℃ 30sec
- STEP3(退火): 55℃ 30sec
- STEP4(延伸): 72℃ 1min
- STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles
- STEP6(最終延伸): 72℃ 10min
- STEP7(臨時(shí)保存): 4℃ forever
- 注意：
- a.PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件包括溫度、時(shí)間和循環(huán)數(shù)等。
- b.STEP4(延伸)的時(shí)間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時(shí)間為1分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為1分鐘，PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為2kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為2分鐘，以此類推。
- c.對(duì)于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確?？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對(duì)于需進(jìn)行半定量反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒(méi)有達(dá)到平臺(tái)期。
常見問(wèn)題：
- 1.PCR產(chǎn)物非常少或沒(méi)有特異性條帶。
- a.引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過(guò)程中最常見的問(wèn)題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問(wèn)題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問(wèn)題。在原有引物效果不佳的情況并且陽(yáng)性對(duì)照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
- b.待擴(kuò)增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會(huì)變得相對(duì)比較困難，此時(shí)可以使用適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說(shuō)明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
- c.長(zhǎng)片段擴(kuò)增。盡管Hot-Start Taq DNA Polymerase可以擴(kuò)增最長(zhǎng)達(dá)8kb的DNA片段，但大多數(shù)時(shí)候比較適合擴(kuò)增3kb以下的片段，更長(zhǎng)片段的擴(kuò)增推薦使用其它更適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增的DNA聚合酶。
- d.PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
- e.由于引物存在一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
- f.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒(méi)有溫度梯度PCR儀，則可以通過(guò)多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
- g.延伸時(shí)間不足?？砂凑彰?kb片段延伸1分鐘進(jìn)行設(shè)置，對(duì)于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸1.5-2分鐘。
- h.待擴(kuò)增片段GC含量較高或長(zhǎng)度較長(zhǎng)，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
- i.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問(wèn)題。
- j.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長(zhǎng)PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過(guò)40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
- k.模板含量太低，適當(dāng)加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，然后對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時(shí)也可以從次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡(jiǎn)單地用原有引物對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不能去除非特異性條帶。
- l.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
- m.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí)，可以適當(dāng)提高退火溫度。
- n.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)有很大幫助。
關(guān)鍵字： Hot-Start Taq DNA Polymerase說(shuō)明書；Hot-Start Taq DNA Polymerase廠家
上?？道噬锟萍加邢薰臼且患壹邪l(fā)、生產(chǎn)、銷售、服務(wù)于一體的一家生物科技企業(yè)，專營(yíng)生化試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、基因、蛋白、抗體、Elisa試劑盒、細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)等高生物產(chǎn)品。總部位于上海，并在北京、廣東，江西，吉林等全國(guó)30多個(gè)省市設(shè)有分公司和代理機(jī)構(gòu)。涉及的產(chǎn)品被中國(guó)科學(xué)院、清華、北大、復(fù)旦，上海交大，復(fù)旦醫(yī)學(xué)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)，華東師范大學(xué)，第二軍醫(yī)大學(xué)，曙光醫(yī)院，浦東新區(qū)人民醫(yī)院等知名科研院所廣泛使用，可靠而穩(wěn)定的質(zhì)量和完善的售后服務(wù)確。