BeyoFusion™ DNA Polymerase

信裕生物生產(chǎn)的BeyoFusion™ DNA Polymerase，是一種以嗜熱古細(xì)菌DNA聚合酶(hyperthermophilic archaeon
Pyrococcus-like DNA polymerase)為基礎(chǔ)通過突變等改造而獲得的超高性能DNA聚合酶，它具有擴增速度快、保真度極高、擴增片段可以輕松達(dá)到12kb等優(yōu)點。
BeyoFusion™ DNA Polymerase擴增速度極快，擴增小于6kb的DNA片段時，延伸1kb只需要15秒(參考表1)。普通的DNA聚合酶延伸1kb通常需要1-2分鐘。BeyoFusion™ DNA polymerase由于其超快的擴增速度，可以顯著縮短PCR擴增所需的時間。
BeyoFusion™ DNA Polymerase是一種高保真DNA聚合酶。BeyoFusion™ DNA Polymerase不僅可以非常高效地催化5’至3’方向的依賴于DNA模板的脫氧核苷酸的聚合反應(yīng)，它同時還具有3’至5’的外切酶活性(proofreading activity)，它的錯誤發(fā)生概率比Taq酶要低52倍，比pfu酶要約低6倍(參考表1)。
表1. BeyoFusion™ DNA polymerase的主要性能與Taq酶及同類產(chǎn)品的比較。

BeyoFusion™ DNA Polymerase的擴增長度長，可以達(dá)到12kb。BeyoFusion™ DNA Polymerase非常適合長片段DNA的擴增，擴增出來的片段可以輕松達(dá)到12kb(參考圖1和表1)，更長片段的擴增效果未經(jīng)測試。BeyoFusion™ DNA聚合酶可以輕松勝任具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的、非常長的DNA片段的準(zhǔn)確擴增，因此它是目的基因擴增和克隆的理想選擇。圖1. BeyoFusion™ DNA polymerase以λDNA為模板，PCR擴增不同長度(0.5-12kb)片段的的電泳圖。來源：BeyoFusion™ DNA polymerase通過大腸桿菌重組、表達(dá)、純化而獲得。
用途：高保真PCR (high fidelity PCR)、點突變、PCR克隆等。BeyoFusion™ DNA polymerase擴增出來的DNA片段為雙平端(參考表1)，可以直接用于雙平端克隆，但不能直接用于常規(guī)的T載體克隆。如需用于T載體克隆，需在BeyoFusion™ DNA polymerase PCR擴增結(jié)束后加入常規(guī)量的普通Taq酶在72°C反應(yīng)5-10分鐘，使每條鏈的3’端加上一個A以形成粘端。
活性定義：One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate 10 nmol of dNTP into acid 
insoluble material in 30 minutes at 74°C.
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)PCR反應(yīng)要求。
酶儲存溶液：20mM Tris-HCl (pH 7.5), 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 100mM KCl, 200μg/ml BSA and 50% (v/v)
glycerol。
失活或抑制：酚氯仿抽提可以使BeyoFusion™ DNA polymerase失活。 
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
PCR反應(yīng)非常靈敏，在進(jìn)行擴增反應(yīng)時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：

1. 1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
   1. a.溶解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將BeyoFusion™ DNA polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
   2. b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)(如果有多個類似的PCR反應(yīng)，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和BeyoFusion™ DNA polymerase的混合物，然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況，有時混合物中可以包括引物)：
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      ▲

       

      擴增片段小于6kb

      擴增片段大于6kb

      試劑

      最終濃度

      體積

      最終濃度

      體積

      雙蒸水或Milli-Q水

      -

      (36.5-x)μl

      -

      (29-y)μl

      10X BeyoFusion™ Buffer
      (with Mg²⁺)

      1X 

      5μl

      1X 

      5μl

      dNTP (2.5mM each)

      0.25mM each

      5μl

      0.5mM each

      10μl

      模板DNA

      10pg-1μg*

      xμl

      10pg-1μg*

      yμl

      引物混合物(10μM each)

      0.2μM each

      1μl

      0.4μM each

      2μl

      BeyoFusion™ DNA polymerase

      2.5U/50μl

      1μl

      2.5U/50μl

      1μl

      總體積

      -

      50μl

      -

      50μl
      • *對于不同類型的模板在50μl反應(yīng)體積中推薦用量如下：哺乳動物基因組DNA：100ng；大腸桿菌基因組DNA：100ng；質(zhì)粒DNA：5-30ng。擴增大于6kb的片段時，模板量宜適當(dāng)加大，但過多的模板DNA也容易導(dǎo)致非特異性的PCR產(chǎn)物。
      • 注意：參考上表，在擴增大于6kb的片段時dNTP和引物的用量比擴增小于6kb片段時加倍。
   3. c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
   4. d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil, ST275)。
   5. e.各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2. 2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下表格：
   ▼

   ▲

   PCR步驟

   擴增片段小于6kb時

   擴增片段大于6kb時

   STEP1(起始變性)

   92℃ 3min

   92℃ 3min

   STEP2(變性)

   92℃ 30sec

   92℃ 30sec

   STEP3(退火)

   55℃ 30sec

   55℃ 30sec

   STEP4(延伸)

   68℃ 15s/kb

   68℃ 1min/kb

   STEP5(循環(huán))

   Go To STEP2 for 30 cycles

   Go To STEP2 for 30 cycles

   STEP6(最終延伸)

   68℃ 10min

   68℃ 15min

   STEP7(臨時保存)

   4℃ forever

   4℃ forever
   1. a.起始變性和變性的溫度設(shè)置為94℃，延伸溫度設(shè)置為72℃，其余條件不變時，都可以進(jìn)行正常的PCR擴增，但擴增效果會稍有下降。對于較難擴增的序列，推薦使用92℃變性和72℃延長。
   2. b.PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的溫度、時間和循環(huán)數(shù)等。
   3. c.STEP4(延伸)的時間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度進(jìn)行設(shè)置，對于本產(chǎn)品擴增小于6kb的DNA片段時，推薦每kb產(chǎn)物的延伸時間為15秒。例如PCR產(chǎn)物的長度為1kb，則延伸時間可以設(shè)置為15秒，PCR產(chǎn)物的長度為2kb，則延伸時間可以設(shè)置為30秒，以此類推。擴增大于6kb的DNA片段時，推薦每kb產(chǎn)物的延伸時間為1分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長度為10kb，則延伸時間可以設(shè)置為10分鐘，PCR產(chǎn)物的長度為12kb，則延伸時間可以設(shè)置為12分鐘，以此類推。
   4. d.對于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確?？梢詳U增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對于需進(jìn)行半定量或定量的PCR反應(yīng)，循環(huán)數(shù)一定要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達(dá)到平臺期。

常見問題：

1. 1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
   1. a.引物設(shè)計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計軟件進(jìn)行引物設(shè)計，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
   2. b.待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。直接添加1-10%DMSO或5-20%甘油對于擴增高GC含量的片段也有幫助。
   3. c.PCR反應(yīng)設(shè)置時在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
   4. d.由于引物存在一定的二級結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
   5. e.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
   6. f.延伸時間不足。可以在推薦的延伸時間基礎(chǔ)上把延伸時間延長2-5倍，對于較難擴增的片段可以設(shè)置為每1kb延伸5分鐘。
   7. g.待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
   8. h.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
   9. i.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
   10. j.模板含量太低，適當(dāng)加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計一對PCR引物，然后對次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴增，這樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從次PCR產(chǎn)物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不能去除非特異性條帶。
   11. k.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
   12. l.對PCR引物進(jìn)行脫鹽純化。
   13. m.使用高質(zhì)量的dNTP混合物。
   14. n.適當(dāng)增加DNA polymerase的用量。
   15. o.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時，可以適當(dāng)提高退火溫度。
   16. p.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ泻艽髱椭?/li>
2. 2.雜帶較多或條帶彌散。
   1. a.退火溫度提高2-5°C。
   2. b.減少DNA模板的用量。
   3. c.PCR反應(yīng)設(shè)置時在室溫進(jìn)行容易產(chǎn)生非特異性條帶。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
   4. d.適當(dāng)減少BeyoFusion™ DNA polymerase用量。
   5. e.適當(dāng)縮短延伸時間。