BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)

BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)，即BeyoRT™ M-MuLV Reverse Transcriptase(RNase H minus)是一種經(jīng)過改造和優(yōu)化的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)。和普通的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶相比，BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)也是一種依賴于RNA或DNA模板的DNA聚合酶，可以以RNA或DNA為模板在引物存在的情況下完成互補DNA鏈的合成；但缺失了Ribonuclease H(RNase H)酶活性，不能夠選擇性剪切RNA和DNA雜合雙鏈中的RNA。BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase 
H-)是最常用的反轉(zhuǎn)錄酶之一。
特點：BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)可以合成長達13kb的cDNA，而普通的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)僅能合成長達9kb的cDNA；BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的最適反應(yīng)溫度為42-45℃并且在55℃時仍然有很高活性，可以避免普通的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)在37℃反應(yīng)時的一些不足。
用途：BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)常用于在獲得總RNA或mRNA后cDNA條鏈的合成。BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)合成的cDNA條鏈后續(xù)可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二條鏈的合成等。BeyoRT™ 
M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)也可以用于DNA探針的標記，通過引物延伸(primer extention)來分析RNA，以及用于基因芯片熒光探針的標記。
來源：本BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)由大腸桿菌表達，表達的基因為經(jīng)過突變優(yōu)化的編碼Moloney Murine 
Leukemia Virus reverse transcriptase的pol基因片段。
活性定義：One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10 min at 37℃. Enzyme activity is assayed in 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 6 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 40 mM KCl, 0.5 mM dTTP, 0.4 MBq/ml [³H]-dTTP, 0.4 mM polyA·oligo(dT)_12-18。
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以滿足常規(guī)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA條鏈等的需要。
酶儲存溶液：50 mM Tris, pH 8.3, 100mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。
Reaction Buffer(5X)：250 mM Tris, pH 8.3 at 25℃, 250 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 50 mM DTT。
失活或抑制：70℃孵育10分鐘可以導致BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)失活；EDTA、EGTA等螯合劑、無機磷酸鹽或焦磷酸鹽以及聚氨(polyamine)對BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)有抑制作用。
本產(chǎn)品中BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的濃度為200U/μl，用于體積為20微升的反轉(zhuǎn)錄體系時足夠進行10次反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項： 
對于GC含量比較高的RNA的反轉(zhuǎn)錄，試劑盒的使用說明中給予了特別說明，請予以關(guān)注。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 
 

使用說明：
1. cDNA條鏈的合成(First-strand cDNA Synthesi)：
a. 參考如下表格設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最終體積為13.7μl。注意：對于GC含量比較高的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 加入DEPC-treated Water混勻后微離心，接著可以在65℃孵育5分鐘，隨后立即置于冰浴以打開RNA的一些比較穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。
RNase Inhibitor可以視其本身的情況加入適當?shù)牧?，例?.5μl或其他適當體積。在加入其他體積時，DEPC-treated Water的用量需適當調(diào)整。
dNTP濃度不同時使用的體積需作適當調(diào)整，此時DEPC-treated Water的用量需適當調(diào)整。
b. 輕輕混勻(可以用Vortex在最低速度輕輕混勻或用移液器吹打混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 如果使用Oligo(dT)₁₈作為引物或使用基因特異性引物，在42℃孵育60分鐘。如果使用rando mhexamer(隨機六聚體)作為引物，先在25℃孵育10分鐘，隨后在42℃孵育60分鐘。注意：對于GC含量比較高的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可以設(shè)置為45℃孵育60分鐘。
d. 70℃孵育10分鐘以失活BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)并終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。說明：對于長片段的cDNA不推薦采用加 熱的方法失活BeyoRT™ M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)，這種操作可能會導致部分長片段 DNA被剪切。
e. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以直接用于后續(xù)的PCR等反應(yīng)，也可以-20℃凍存以備以后使用。用于后續(xù)PCR反應(yīng)時，如果PCR的反應(yīng)體系為 50微升，則推薦使用2微升反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
2. 其他用途請自行參考M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的相關(guān)文獻資料進行。
常見問題：
1. 總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳觀察不到。
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由于是從模板反轉(zhuǎn)錄而獲得，而模板的量本身比較低，反轉(zhuǎn)錄的量通常還要少于模板量，因此通常總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接電泳觀察是觀察不到的。
2. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過PCR擴增沒有特異性條帶。
PCR擴增沒有獲得特異性條帶時建議先使用actin、GAPDH等作為內(nèi)參進行PCR擴增，看是否可以成功擴增。如果可以成功，則說明PCR擴增體系沒有問題，此時通常是目的基因的引物設(shè)計欠佳，當然也有可能是反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。如果內(nèi)參不能被很好地擴增，則有可能PCR體系存在問題或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。