中pH緩沖液套裝
產(chǎn)品及特點(diǎn)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE)是目前電泳法分離活性蛋白的 主要方法之一,跟 SDS-PAGE 根據(jù)分子量大小分離蛋白質(zhì)不同,它主要根 據(jù)蛋白質(zhì)的 pI 分離蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)的 pI 各不相同,所以對(duì)不同靶蛋白 質(zhì)需要選用具有不同 pH 的電泳體系。單獨(dú)配制不同 pH 的 Native PAGE 電 泳膠十分繁瑣,為此本公司開(kāi)發(fā)了本產(chǎn)品。它有下列特點(diǎn):
1. 即開(kāi)即用,用戶不需單獨(dú)準(zhǔn)備各種成分,十分方便。
2. 非變性,電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)保持天然的構(gòu)象和亞基之間的相互作用,得到 的蛋白質(zhì)一般都具有生物活性(而 SDS-PAGE 得到的蛋白沒(méi)有活性)。
3. 可以用于分析蛋白質(zhì)和 DNA 或 RNA 的相互作用、蛋白修飾、蛋白構(gòu)型 改變、回收有活性蛋白質(zhì)等試驗(yàn)。
4. 電泳后可直接用于考染、銀染、Western 雜交等實(shí)驗(yàn)。
5. 提供具有3種不同pH的緩沖液套裝,便于客戶選擇最適合的緩沖液體系。
規(guī)格及成分成 份 編 號(hào) 大紙盒包裝
丙烯酰胺干粉 LM100864 60 g(250mL 棕色塑料瓶)
甲叉雙丙烯酰胺干粉 100877 3 g
TEMED 100880 1.5 mL(棕色管)
過(guò)硫酸銨干粉 100879 1 g(本色蓋)
高中低緩沖液套裝選一 ABC 之一(見(jiàn)下)
使用手冊(cè) 81212sc 1 份
高 pH 緩沖液套裝(編號(hào) 100828,只有 81212A-30 有此成分)
高 pH 濃縮膠配膠液(pH 6.7),4× 100828a 100 mL
高 pH 分離膠配膠液(pH 8.9),4× 100828b 200 mL
高 pH 電泳液(pH 8.3) 100828c 10 L(干粉)
高 pH 上樣液,5× 100828d 1 mL
中 pH 緩沖液套裝(編號(hào) 100829,只有 81212B-30 有此成分)
中 pH 濃縮膠配膠液(pH 5.5),4× 100829a 100 mL
中 pH 分離膠配膠液(pH 7.5),4× 100829b 200 mL
中 pH 電泳液(pH 7.0)干粉 A 100829c 55.2g
中 pH 電泳液(pH 7.0)干粉 B 100829d 10g
中 pH 上樣液,5× 100829e 1 mL
低 pH 緩沖液套裝(編號(hào) 100830,只有 81212C-30 有此成分)
低 pH 濃縮膠配膠液(pH 6.7),4× 100830a 100 mL
低 pH 分離膠配膠液(pH 4.3),4× 100830b 200 mL
低 pH 電泳液(pH 4.5) 100830c 10 L(干粉)
低 pH 上樣液,5× 100830d 1 mL
運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存,上樣液需低溫運(yùn)輸、-20℃保存,保存期為一年。
自備試劑 去離子水、天然 PAGE 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)或蛋白質(zhì)等電電泳標(biāo)準(zhǔn)品
使用方法 特別說(shuō)明:如何選擇緩沖液高、中低 pH 緩沖液套裝一定要配套使用。選擇適當(dāng) pH 的緩沖液(包括上樣液,電泳液,配膠液等)對(duì)蛋白質(zhì)非變性 PAGE 非常重要,此又跟靶蛋白質(zhì)的 pI 值密切相關(guān)。如果緩沖液的 pH 遠(yuǎn)離靶蛋白的 pI,則蛋白質(zhì)分子帶
電多(電荷密度大),電泳速度快,分辨率高。但過(guò)酸過(guò)堿又容易使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性,失去活性,所以佳 pH 條件就是在電泳分辨率和維持活性之間尋找平衡,需要針對(duì)每種蛋白質(zhì)進(jìn)行摸索或通過(guò)滴定曲線來(lái)確定,沒(méi)有通用的電泳緩沖體系。由于有近半數(shù)的蛋白質(zhì) pI 在 4-6.5,所以在不知道靶蛋白的 pI 時(shí),可以先選用高 pH 緩沖系統(tǒng)。
一:配制分離膠
1. 確定濃度。對(duì)分子量在 100Kd 以上的蛋白質(zhì),可選用 3-5%的膠;對(duì)分子量在 20-150KD 之間的蛋白質(zhì),可選用 5-10%的膠;對(duì)分子量在10-80KD 之間的蛋白質(zhì),可選用 10-15%的膠。對(duì)未知樣品,建議使用7.5%的膠。
2. 配制 10%的 APS(過(guò)硫酸銨):按每 0.1 克過(guò)硫酸銨干粉加 1 mL 去離子水的比例配制 10%的 APS 溶液,該溶液可以在 4℃存放一周。
3. 配制 30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺(19:1)溶液:在本產(chǎn)品提供的裝有60 克丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入 146 mL 自備的去離子水和 3g 甲叉雙丙烯酰胺,充分搖晃直到溶解(約需 10-20 分鐘)即得 200 mL 30%丙烯酰胺(19:1)溶液。此溶液好在一個(gè)月內(nèi)用完,必須 4℃避光保存。
4. 配 10 mL 分離膠(如果配制其他體積,請(qǐng)按比例調(diào)節(jié)各成分用量): 在一個(gè)25 mL 的三角瓶中,先加入 4.2 mL 去離子水、3.3 mL 30%丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(19:1)溶液和2.5 mL 4×分離膠配膠液。
5. 搖晃混勻后抽真空 10-15 分鐘以去除溶液中的氧氣(氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應(yīng),不去除的話將影響丙烯酰胺聚合反應(yīng))。
6. 加入 50uL 新配制的 10%APS 和 10uL TEMED(這是配制 10 mL 膠的用量,配制更大體積的膠則按比例增加),迅速搖勻后倒膠。注意:如果購(gòu)買的是低 pH 緩沖系統(tǒng),由于在低 pH 緩沖液中 PAGE 聚合速度降低,
所以需要加倍上述兩成分的用量。
7. 在膠面距離頂部 1-1.5 cm 的時(shí)候停止灌膠。然后覆蓋一層 1-5 mm 厚的水,使膠頂部液面平整。由于比重不同,水和丙烯酰胺溶液不會(huì)混合。
8. 室溫聚合 30-60 分鐘后,用 1×分離膠配膠液洗滌凝固的膠的頂部,待用。
二:配制濃縮膠(濃縮膠可以提高分辨率,適合于成分復(fù)雜的樣品,一般使用濃度為 4%。使用濃縮膠時(shí)蛋白質(zhì)泳動(dòng)速度主要跟其尺寸和形狀相關(guān)。因濃縮膠 pH 跟分離膠 pH 不同,蛋白質(zhì)可能會(huì)發(fā)生聚合和沉淀。對(duì)成分單一的樣品,可以不用濃縮膠,此時(shí)蛋白的泳動(dòng)速度主要跟其電荷密度,尺寸和形狀相關(guān)。)
1. 配 10 mL 濃縮膠(如果配制其他體積,請(qǐng)按比例調(diào)節(jié)各成分用量): 在一個(gè)25 mL 的三角瓶中,先加入 6.2 mL 去離子水、1.3 mL 30%丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(19:1)溶液和2.5mL 4×濃縮配膠液。
2. 搖晃混勻后抽真空 10-15 分鐘以去除溶液中的氧氣(氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應(yīng),不去除將影響丙烯酰胺聚合反應(yīng))。
3. 按上表用量加入 50uL 10%APS 和 15uL TEMED(這是配制 10 mL 膠的用量,配制更大體積的膠則用量需按比例增加),迅速搖勻后在已經(jīng)凝固的分離膠上倒膠。
4. 在液面達(dá)到頂部時(shí)停止灌膠,插入梳子。
5. 室溫聚合 30-60 分鐘,拔出梳子,用 1×電泳液沖洗加樣孔。
三:電泳
1. 將凝膠板固定在電泳裝置上,往上槽和下槽加入足夠 1×電泳液。注:本產(chǎn)品提供 10 升電泳液,對(duì)低和高 pH 電泳液,用前需將所有干粉溶解在1 L 水中得 10×電泳液,可以室溫放置,用時(shí)再稀釋成 1×電泳液。一般不需要再調(diào)節(jié) pH,但保險(xiǎn)起見(jiàn),可以用 pH 試紙測(cè)試一下 1×電泳液。低和高 pH 電泳緩沖液的 pH 分別是 4.5 和 8.3。對(duì)中 pH 電泳液,其干粉只能配 1×電泳液,否則不溶解。配制時(shí)稱取中 pH 電泳液(pH 7.0)
干粉 A, 5.52g, 中 pH 電泳液(pH 7.0)干粉 B 1g 混勻,加去離子水至徹底溶解,調(diào) pH 到 7.0,定容至 1L??蛻舾鶕?jù)可實(shí)際需要量按比例增減。
2. 連接電極。如果濃縮膠和分離膠的 pH 高于靶蛋白 pI,靶蛋白將帶負(fù)電荷并向陽(yáng)極移動(dòng),可以按標(biāo)準(zhǔn)的 SDS-PAGE 方法接通電極(上陰極下陽(yáng)極);如果濃縮膠和分離膠pH低于靶蛋白pI,靶蛋白將帶正電荷并向陰級(jí)移動(dòng),此時(shí)應(yīng)該下陰極上陽(yáng)極。
3. 300V 預(yù)電泳直到電流不再降低(約需要 30 分鐘)以去除殘留過(guò)硫酸銨。
4. 換電泳液。
5. 在液體蛋白質(zhì)樣品中加入 5×上樣液(16 uL 液體樣品加 4uL 上樣液)后上樣。0.75 mm 厚的膠可以上 10 uL,1.5 mm 厚的膠可以上 20 uL。在未用加樣孔中也要加 1×上樣液以防有樣品的空道的樣品擴(kuò)散。注意:如果用考染檢測(cè),每個(gè)孔的蛋白好在 50-100 ug 總蛋白,如果銀染則只需要 1ug 即可。樣品如果是蛋白質(zhì)沉淀,可用 1×上樣液直接溶解蛋白質(zhì)沉淀后再上樣。蛋白質(zhì)溶液或沉淀中不能含有能夠改變上樣液 pH 的殘留成分(如蛋白質(zhì)沉淀劑 TCA),用前好用 pH 試紙測(cè)試一下,不在上樣液的 pH 范圍時(shí)就用酸或堿調(diào)到正常范圍。大量樣品可用透析法調(diào) pH。
6. 上樣自備的天然 PAGE 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)或等電電泳的標(biāo)準(zhǔn)品(如果有的話)。
7. 用 15 mA(對(duì) 0.75 mm 厚的膠)或 30 mM(對(duì) 1.5mm 厚的膠)的電流電泳直到染料移動(dòng)到分離膠底部。微型膠一般需要 1-2 小時(shí)。注意:電
泳過(guò)程好在冷室或有冷卻系統(tǒng),以免電泳產(chǎn)熱使蛋白質(zhì)變性。
8. 終止電泳,取出凝膠進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)處理(如染色或酶活性檢測(cè))。
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