一站式GST標記蛋白質(zhì)微量純化套裝

產(chǎn)品及特點重組蛋白 N 端的 GST 谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S Transferase） 能提高重組蛋白的水溶性，所以常用于蛋白質(zhì)重組表達。GST-谷胱甘肽親和層 析是利用 GST 標記的蛋白能與谷胱甘肽層析介質(zhì)結(jié)合，并能被還原型谷胱甘肽 洗脫的特點而建立，是目前分離純化 GST 標記蛋白質(zhì)的重要方法。本產(chǎn)品就是 專門用于上述目的，具有下列特點：

1. 一站式套裝，含所需的谷胱甘肽介質(zhì)、溶液和層析柱，用戶只需要提供表達 GST 標記蛋白的細菌（酵母、桿狀病毒、培養(yǎng)細胞）即可，非常方便。

2. 專一性強，一次過柱即可獲得純度高達 95%的 GST-標記蛋白。

3. 只能在非變性條件下使用，只可用于純化沒形成包涵體的 GST 標記蛋白。

4. 每次可以處理 20 mL 的表達菌液，適合初步篩選和鑒定。

5. 提供 4 mL 濃度為 50%的谷胱甘肽-Agarose 介質(zhì)，可吸附 5-10 mg GST 標記蛋白質(zhì)。

6. 本介質(zhì)可以反復使用多次。
規(guī)格及成分 成份 編號 小扁盒包裝 保存
谷胱甘肽-瓊脂糖介質(zhì)，50% 120101 4 mL 2-8℃
10×PBS 緩沖液 100215 100 mL 常溫
GST 標簽蛋白純化溶液 A 111116a 1 mL 常溫
GST 洗脫緩沖液成分一 111116b1 25 mL 常溫
GST 洗脫緩沖液成分二 111116b2 80 mg 常溫
溶菌酶（20 KU/mg） 100406 30 mg -20℃
Benzonase（1U/uL） 101001 100 uL -20℃
PMSF（10 mg/mL） 100853 1 mL -20℃
6 mL 層析柱(帶篩板) 110809 1 套 常溫
使用手冊 111116sc 1 份 常溫

運輸及保存 常溫運輸和保存，谷胱甘肽-瓊脂糖介質(zhì)需常溫運輸 4℃保存，溶菌酶Benzonase 和 PMSF 需低溫運輸，-20℃保存。有效期一年

自備試劑 超純水

使用方法 一:重組蛋白的表達和細菌收集

1. 37℃振蕩培養(yǎng) 20 mL 含表達質(zhì)粒的細菌到 OD600=0.6-0.8。

2. 加 IPTG 到終濃度為 0.1 mM，30℃振蕩培養(yǎng) 3 小時或 22℃振蕩培養(yǎng) 8 小

時（或過夜）。

3. 4℃ 5000 g 離心 10 分鐘收集 20 mL 表達菌液，棄上清。

4. 用 1×PBS 緩沖液重懸細菌沉淀，4℃ 5000 g 離心 10 分鐘，棄上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。1×PBS 緩沖液可用自備的超純水稀釋本試劑盒提供的 10×PBS 緩沖液而得。PBS 緩沖液極其容易長細菌，注意防止污染。

二：細胞裂解

5. 如果用超聲波破碎細胞，先用 1 mL 冰浴的新鮮配制的細胞裂解液重懸細菌沉淀（細胞裂解液的配制方法：在 1 mL 1×PBS 緩沖液中加入 50 uL 溶液

A 和 50 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液，混勻即可）。冰上超聲裂解重懸菌體直到在顯微鏡下看見絕大多數(shù)細胞破裂。超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號自行摸索，一般選 1K-10K 頻率處理 15 次，每次 20 秒，間隔 1 分鐘（必需放置在冰上）。裂解物不能粘稠，否則會堵塞層析柱。

6. 如果用酶法破裂細胞，則在 1 mL 冰浴的、新鮮配制的細胞裂解液重懸細菌（細胞裂解液配制方法：在 1 mL 1×PBS 緩沖液中加入 1.5 mg 溶菌酶干粉、50 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液和 5 uL Benzonase 溶液，混勻即可）。

將重懸細菌冰上放置 30 分鐘，得到細菌裂解物。

7. 將超聲或酶法得到的細胞裂解物在 13000 g 4℃離心 10 分鐘去除未裂解細胞和裂解細胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性 GST 標記蛋白。預留少量（如 100uL）作為裂解液留樣，其余用于第 10 步的過柱。

三：層析柱的制備和 GST 蛋白純化

8. 搖晃將 4mL 谷胱甘肽-瓊脂糖介質(zhì)充分混勻后，全部加入到預放了一片篩板的層析柱中（介質(zhì)的低用量需要根據(jù) GST 蛋白產(chǎn)量決定，100 mL 菌液最少需要使用 200 uL 介質(zhì)。此處加 2mL 則綽綽有余）。下列步驟各溶液的用量均針對 4mL 介質(zhì)而定，如果介質(zhì)用量不同，各溶液用量需相應調(diào)整。

9. 用 40 mL 預冷的 1×PBS 緩沖液洗柱。

10.將第 7 步得到的上清液（含可溶性 GST 標記蛋白）上柱，讓重力使上柱液自然流出，收集并保存穿透液用于 SDS-PAGE 電泳。GST 和谷胱甘肽之間的結(jié)合很緩慢，所以流速一定不能快，否則結(jié)合不充分。流速一般在 0.2-1mL/分鐘即可。如要提高 GST 標記蛋白與介質(zhì)的結(jié)合效率，可用本試劑盒提供的紅蓋將層析柱下的漏液口堵上，讓細菌裂解液和介質(zhì)在 4℃結(jié)合 30分鐘或過夜。也可以將穿透液反復上柱。

11.用 10 mL 1×PBS 緩沖液洗柱，收集并保存穿透液（含雜蛋白）并預留100uL 作為穿透液留樣，其余在確認實驗成功后再丟棄。

12.用 0.2-0.5 mL GST 洗脫液洗柱，收集并保存穿透液，此穿透液即純化的GST 標記蛋白樣品。GST 洗脫液的配制方法是將約 80mg GST 洗脫液成分二干粉全部加入到 GST 洗脫液成分一溶液中，搖晃直到干粉全部溶解即得GST 洗脫液，分裝成小份放-20℃保存，每次用一管。由于它可能含蛋白酶污染，所以純化樣品不能在 4℃長期放置，需留 100uL 左右用于后續(xù)濃度測定或/和 SDS-PAGE 電泳，其余放-80℃長期放置。

13.用裂解液留樣（第 7 步）、穿透液留樣（第 11 步）和純化樣品留樣（第 12步）進行蛋白定量或/和 SDS-PAGE 分析。注意：本操作沒有預先脫鹽，故只能用 Bradford 法或 OD 檢測法測定裂解液留樣、穿透液留樣和樣品留樣的蛋白濃度。按 OD 檢測法，1 OD280 約等于 0.5 mg/mL 蛋白。由于

GST 的分子量為 26 KD，所以在 SDS-PAGE 膠上，GST 標記蛋白將比天

然蛋白大 26 KD。

附：GST 柱的恢復（本試劑盒不含所需試劑）

1. 用 3 倍介質(zhì)體積的 6 M 鹽酸胍處理柱子 10 分鐘。介質(zhì)為 2mL 則用 6mL，下同。

2. 用 3 倍介質(zhì)體積的超純水處理柱子 10 分鐘。

3. 用 3 倍介質(zhì)體積的緩沖液一（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 8.5）處理柱子 10 分鐘。

4. 用 3 倍介質(zhì)體積的緩沖液二（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 4.5）處理柱子 10 分鐘。

5. 再重復 3-4 步兩次。

6. 用 3 倍介質(zhì)體積的超純水處理柱子 3 次。

7. 若需要立即使用，則用 3 倍介質(zhì)體積的 1×PBS 緩沖液處理柱子 2 次。堵上漏口，加 3 倍介質(zhì)體積的 1×PBS 緩沖液洗滌后立即使用。

8. 若長時間不用，則上步的 1×PBS 改成 20%的乙醇，其余操作完全相同。