細胞核蛋白提取試劑盒（溶脹法）

產品及特點DNA 只存在于細胞核內，因此參與轉錄調節(jié)和 DNA 復制的蛋白質主要存在于 細胞核中，要研究蛋白質與 DNA 的相互作用，首先需要制備能夠與 DNA 作用的 天然細胞核蛋白質。目前、細胞核蛋白質制備方法一般都比較繁瑣，一次處理大量 樣品時尤其不便，為此本公司基于溶脹法原理開發(fā)了本產品，用于從哺乳動物組織 和培養(yǎng)細胞核蛋白的溫和微量提取，它具有下列特點：

1. 提取制備過程簡便，只需要一小時。

2. 實驗重復性好，尤其適合同時處理多個樣品。

3. 可用于培養(yǎng)的動物細胞，也可以用于新鮮組織細胞。

4. 提取步驟溫和，制備的核蛋白能保持天然活性，可以直接用于轉錄因子活性分 析、凝膠阻滯實驗(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、DNA 足跡圖實驗和甲基化干擾實驗酶活性測定等研究。

5. 1×10E6 個細胞中可以得到 50-70 ug 的核蛋白質。

6. 只適用于哺乳動物組織和培養(yǎng)細胞，不適用于植物和真菌等生物。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 小扁盒包裝
動物細胞溶脹液 LM91203 50 mL
動物細胞核溶脹液 LM90613b 10 mL
使用手冊 LM90613sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸和保存，有效期一年。

自備試劑 PMSF、DTT、PBS、胰酶溶液等

使用方法實驗前準備：取適當量（根據樣品數量確定）的動物細胞溶脹液和動物細胞核溶脹 液到新的塑料瓶中，置于冰上預冷，并在使用前數分鐘內同時向動物細胞溶脹 液和動物細胞核溶脹液中加入自備的 PMSF 和 DTT，使 PMSF 的最終濃度為 0.2 mM，DTT 的最終濃度為 1 mM。實驗中所用試劑均需先預冷。 一、提取培養(yǎng)細胞和懸浮細胞細胞核：

1. 培養(yǎng)細胞：將覆蓋率為 55-65%的培養(yǎng)細胞用自備的胰酶溶液按標準的胰酶法 處理，然后刮到 1.5 mL 塑料離心管中，4℃ 600g 離心 3 分鐘，小心棄上清。 細胞數量在 5×10E5-7 個。細胞沉淀體積約 0.1mL。

2. 懸浮細胞：直接將 5×10E5-7 個懸浮細胞轉移到 1.5 mL 塑料離心管中，4℃ 600g 離心 3 分鐘，小心棄上清。細胞沉淀體積約 0.1mL。

3. 用 1mL 自備的預冷的 PBS 緩沖液重懸細胞沉淀，然后 4℃ 600g 離心 3 分 鐘，小心棄上清。注意：必須盡快用 PBS 緩沖液洗滌細胞沉淀，否則沉淀細 胞產生的 CO2 將使局部 pH 減低產生毒性。

4. 在細胞沉淀中加入 1mL 預加了 PMSF 和 DTT 的動物細胞溶脹液，用手指輕 柔彈管壁使細胞沉淀懸浮起來。不要用槍頭。

5. 冰浴 10 分鐘。如果有條件可以取少量樣品涂片，在顯微鏡下觀察，90%的細 胞將呈現氣球狀。如果沒有則繼續(xù)冰浴直到 90%的細胞呈現氣球狀。

6. 渦旋激烈震蕩 10-30 秒混勻。如果有 Dounce 玻璃勻漿器，也可以用預冷的 勻漿器勻漿 10-12 次。如果有條件可以取少量樣品涂片，在顯微鏡下觀察， 90%的細胞將破裂。如果未破裂細胞折光度高，并且沒有膨脹，則表示這些細 胞已經死亡。如果這樣的細胞太多，則需要重新取樣。

7. 4℃ 1000g 離心 3 分鐘，小心棄上清。沉淀為細胞核，上清為胞漿成分，如 果需要可以留存上清。

8. 在細胞核沉淀中加入 100 μL 預加了 PMSF 和 DTT 的、預冷的動物細胞核溶 脹液，輕彈離心管混勻，使沉淀懸浮起來。

9. 冰浴 20 分鐘。

10. 4℃ 1000g 離心 2 分鐘，小心收集上清液（細胞核提取物），可立即用于后續(xù) 的凝膠滯后實驗、BCA 法蛋白濃度測定、活性檢測、SDS-PAGE 電泳、2D 電泳等實驗，也可以分裝后放-70℃長期保存。 說明：本方法可以從 1×10E6 個細胞中得到 50-70 ug 的核蛋白質。 二、對新鮮組織：

11. 將 100-150 mg 新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用手術剪將組織盡可能切成非常細 小的碎片，盡量去除脂肪組織和結締組織等非目的組織，用自備的 PBS 緩沖 液洗滌 2 次，離心后去上清。在組織沉淀中加入 400 uL 預加了 PMSF 和 DTT 的動物細胞溶脹液，在預冷的玻璃勻漿器內充分勻漿。勻漿需在冰浴或 4oC 進行。

12. 勻漿后把勻漿液轉移到塑料離心管內，用手指彈管壁使沉淀懸浮起來，冰浴放 置 10-20 分鐘，渦旋激烈震蕩 10 秒混勻。

13. 接下來按照步驟 7-10 操作，即得到新鮮組織細胞核蛋白提取物。