5’RACE試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)研究真核基因的最基礎(chǔ)的工作之一就是確定其轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，目前最通用的方 法是 3′-RACE 法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是 Frohman 發(fā)明的、通過 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技術(shù)，它在不建立 cDNA 文庫(kù)的前提下， 利用已知 cDNA 序列設(shè)計(jì)引物，通過往兩端延伸和擴(kuò)增獲得其 3′-端序列。本試劑 盒就是根據(jù) 3′-RACE 原理而開發(fā)，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，客戶不需要單獨(dú)準(zhǔn)備各種材料。
2. 反應(yīng)條件經(jīng)過精心優(yōu)化，包括使用無 RNase H 活性的 MMLV 和優(yōu)化的引物。
5’RACE試劑盒
規(guī)格及成分 成 分 編 號(hào) 十孔盒包裝
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶-RI 混合液 101104a 20 μL（紅蓋）
MMLV Buffer-dNTP 混合液 101105b 60 μL（本色蓋）
微量核酸沉淀劑 50903 400 μL（綠蓋）
TdT（末端轉(zhuǎn)移酶） 120312 10 μL（白蓋）
2×TdT Buffer（含 dATP） 101105c 200 μL（黃蓋）
PCR MagicMix 3.0（含染料） 90805 1mL×2（紅蓋）
5′RACE 引物 A-引物 B 混合液 yw373374 200 μL（藍(lán)蓋）
5′RACE 引物 C yw375 200 μL（紫蓋）
RNase-Free 水 80403 1 mL（亮黃蓋）
使用手冊(cè) 101105sc 1 份
自備試劑
Poly(A) RNA（或總 RNA）、基因?qū)Ｒ恍砸?A、B、C、75%乙醇。注
自備試劑 Poly(A) RNA（或總 RNA）、基因?qū)Ｒ恍砸?A、基因?qū)Ｒ恍砸?B、超純水。
5’RACE試劑盒運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存、有效期一年。
使用方法 一：引物的設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備工作
利用已道序列的區(qū)域設(shè)計(jì)基因?qū)Ｒ恍砸锶龡l（A、B），其中引物 B 和 A 引物 比較，靠 3’端 10-30 個(gè)堿基，類似巢式 PCR 的引物設(shè)計(jì)。自備的基因?qū)Ｒ恍砸?的 Tm 跟 3′-RACE 引物 B 和引物 C 的一致，即 Tm 為 58℃。引物合成后加 超純水使其濃度為 10 μM，放冰上待用。
二：利用含 Oligo(dT)的 3’-RACE 引物 A 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄
注意：MMLV 酶使用前必須短暫離心，因?yàn)樗?50%甘油，及其粘稠，否則將取不 到所需體積。
1. 在一個(gè) PCR 管中，加入以下組分：
成分 用量
Poly(A) RNA（或總RNA ） 0.2-2 μg（5 μg）
3′-RACE引物A（10 μM） 1 μL
MMLV Buffer (含dNTP溶液) 5 μL
RNase-Free水 補(bǔ)至19 μL
合計(jì) 19 μL
注意：如果可能，使用Poly(A) RNA作為模板。
2. 65℃保溫 5 分鐘, 展開 RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，立即冰浴待用。
3. 在冰浴的 PCR 管中加入 1 μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶-RI 混合物。
4. 先 37℃保溫 60 分鐘，再 42℃保溫 30 分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后 50℃保溫 10 分鐘終止反應(yīng)。
5. 加入 0.5 mL RNase-free 水稀釋上步得到的 cDNA，冰浴待用。長(zhǎng)期放置需要 放-20℃保存。
三：利用基因?qū)Ｒ恍砸?A 和 3′ RACE 引物 B 進(jìn)行輪 PCR
6. 用不同量的 RT 反應(yīng)液（即稀釋后的 cDNA 模板）設(shè)置 PCR，樣品組需要設(shè)置 模板用量梯度，單位：μL。
7. 按下列參數(shù)進(jìn)行 cDNA 第二鏈的合成和 PCR：
第 1 步，cDNA 第二鏈的合成：52-60℃ 2 分，72℃ 40 分（此步的目地是合 成第二鏈的 cDNA，復(fù)性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸?A 的 Tm 值決定， 一般可以從 55℃開始）。
第二步 PCR 循環(huán)：94℃ 1 分鐘，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（此步為 PCR 擴(kuò) 增，復(fù)性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸?A 的 Tm 值決定，一般可以從 55℃ 開始）。 最后延伸：72℃ 15 分
8. 取 5 μL PCR 反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以確認(rèn) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。若得到目的擴(kuò) 增產(chǎn)物需要用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)于-20℃保存；若沒有得到目的擴(kuò)增產(chǎn)物，可按下 列步驟進(jìn)行巢式 PCR 反應(yīng)。
四：利用基因?qū)Ｒ恍砸?B 和 3′
9. 將上輪 PCR 產(chǎn)物（4 管）用水稀釋約 20 倍（在 50μL PCR 反應(yīng)液中加入 1mL 超純水），然后分別作為模板進(jìn)行巢式 PCR 擴(kuò)增。
10. PCR 反應(yīng)。按下列條件進(jìn)行 PCR： 第 1-30 次循環(huán)：94℃ 1 分鐘，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（復(fù)性溫度需要根 據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸?B 的 Tm 值進(jìn)行優(yōu)化，一般可以從 55℃開始）。最后延 伸：72℃ 15 分。
11. 電泳檢測(cè)。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行 DNA 測(cè)序或 TA 克隆。
關(guān)鍵字： 5’RACE試劑盒廠家；5’RACE試劑盒現(xiàn)貨
上?？道噬锟萍加邢薰臼且患壹邪l(fā)、生產(chǎn)、銷售、服務(wù)于一體的一家生物科技企業(yè)，專營(yíng)生化試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、基因、蛋白、抗體、Elisa試劑盒、細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)等高生物產(chǎn)品?？偛课挥谏虾?，并在北京、廣東，江西，吉林等全國(guó)30多個(gè)省市設(shè)有分公司和代理機(jī)構(gòu)。涉及的產(chǎn)品被中國(guó)科學(xué)院、清華、北大、復(fù)旦，上海交大，復(fù)旦醫(yī)學(xué)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)，華東師范大學(xué)，第二軍醫(yī)大學(xué)，曙光醫(yī)院，浦東新區(qū)人民醫(yī)院等知名科研院所廣泛使用，可靠而穩(wěn)定的質(zhì)量和完善的售后服務(wù)確。