動物線粒體純化試劑盒
產品及特點線粒體是非常重要的細胞器，它不但跟很多人類疾病相關，而且還是母系遺傳研 究的重要材料。對線粒體進行遺傳研究和生化研究都需要純化線粒體。本產品可用于 純化動物細胞線粒體的試劑盒。它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶不需要自己配制各種溶液，優(yōu)化各種條件。

2. 本試劑盒有粗提和精提兩個操作選項，但是精提需要超速離心機。粗提所得線粒 體可以直接用于蛋白分析（SDS-PAGE、Western Blot、ELISA 等）、蛋白組分 析和線粒體 DNA 純化。精提線粒體可以用于偶聯(lián)分析和體外線粒體蛋白合成等 實驗。

3. 本產品一次可以處理約 2×108個培養(yǎng)細胞，30 mg 培養(yǎng)細胞（相當于 15 瓶 150 mm 培養(yǎng)細胞）可以純化到到 0.5-1.5 mg 線粒體。

4. 本產品適用于各種動物懸浮培養(yǎng)細胞和貼壁培養(yǎng)細胞，不能用于動物實體組織。

5. 提供線粒體染液，可以在操作中隨時監(jiān)測純化過程中線粒體的完整性。 
動物線粒體純化試劑盒
規(guī)格及成分 成份 編號 大扁紙盒包裝
動物線粒體純化溶液 A 111207a 50 mL
動物線粒體純化溶液 B 111207b 250 mL×2
蔗糖 111207c 100 g（干粉瓶）
詹納斯綠 B 染色液（0.2%） 111207d 1 mL（棕色管）
使用手冊 111207sc 1 份

動物線粒體純化試劑盒運輸及保存 常溫運輸和保存, 保存期限一年。

自備試劑 PBS 緩沖液。 

使用方法注意：線粒體膜對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上或冷室進行，所要用到的

溶液和離心管都必須預先冷卻，否則線粒體容易破裂。

一：準備工作（此步驟同柱式動物線粒體 DNAout 中線粒體提取步驟）。未用完的下

列溶液需要-20℃保存，否則容易長菌。下次使用前務必讓沉淀溶解并搖晃均勻。

1. 將溶液 A 和溶液 B 放冰上預冷待用。

2. 配制 1.7M 高比重溶液（精提時需要配制此溶液，粗提時不需要配制此溶液）：

36 克蔗糖用溶液 B 溶解并定溶到 60mL，冰上預冷待用。

3. 配制 1.0M 低比重溶液。粗提時需要低比重溶液 100mL，配制方法是將 34 克蔗糖用溶液 B 溶解并定溶到 100mL，冰上預冷待用。精提時需要低比重溶液150mL，配制方法是將 51 克蔗糖用溶液 B 溶解并定溶到 150mL，冰上預冷待用。Dounce 勻漿器

4. 配制線粒體重懸液。粗提時需要重懸液 200mL，配制方法是將 150 mL 溶液 B

和 50 mL 1.0M 低比重溶液混合；精提時需要重懸液 300mL，配制方法是將 225

mL 溶液 B 和 75 mL 1.0M 低比重溶液混合，即得 300mL 線粒體重懸液，冰

上預冷待用。

二：線粒體粗提（此步驟同柱式動物線粒體 DNAout 中線粒體提取步驟）

5. 如果提取材料是單層細胞，先用 60 mL 自備的 PBS 緩沖液洗滌 2×108個培養(yǎng)

的單層細胞，共洗滌 2 次。然后用塑料刮匙刮下細胞，重懸在 60 mL PBS 緩沖

液中。如果是懸浮細胞，則 1000g 4℃離心 10 分鐘收集 2×108個細胞，再用

60 mL PBS 緩沖液洗滌 2 次，最后將細胞重懸在 60 mL PBS 緩沖液中。

6. 用平甩轉子（swinging-bucket rotor）離心機 1000 g 4℃離心 10 分鐘，吸棄

上清，保留細胞沉淀。

7. 加入 5 倍體積(以細胞沉淀的體積為基數(shù))的預冷的溶液 A，輕柔重懸細胞。

8. 冰上放置 4-5 分鐘。注意：冰浴時間不要超過 5 分鐘。

9. 如果是成纖維細胞，由于其難以裂解，可將細胞重懸液在-80℃放置 20-30 分鐘

后再化凍，然后進入下步操作。如果不是成纖維細胞，則直接進入下步操作。

10. 將細胞重懸液體轉移到預冷的 Dounce 玻璃勻漿器中（工作體積為 10-15 mL，

間隙為 0.12 mm，是玻璃材質，否則線粒體產率會降低）勻漿適當次數(shù)。

細胞株不同，其最適勻漿次數(shù)不同，一般需要 40 次-60 次左右。勻漿是線粒體

純化最關鍵的步驟，故勻漿前先通過預實驗確定最適勻漿次數(shù)，方法是每勻

漿 5-10 次后，取 2-3 uL 勻漿液到載玻片上，然后在相差顯微鏡下觀察，完整

細胞數(shù)量降低到 20%以下為佳。

11. 加入 1/3 體積的、預冷的 1.0 M 低比重溶液，輕柔混勻。

12. 用平甩轉子離心機 4℃ 1000 g 離心 10 分鐘。沉淀含殘留完整細胞、細胞碎片

和細胞核，上清液含線粒體。

13. 轉移上清液到離心管中，冰上放置。在顯微鏡下檢測上清液中線粒體的完整性。

具體做法是先滴 50uL 左右上清液到載玻片上，再滴入 50 uL 詹納斯染液綠 B

染色液 20 分鐘，油鏡下觀察，藍綠色顆粒狀物即為線粒體。

14. 用固定角度轉子（fixed-angle rotor）離心機 4℃ 15000 g 離心 15 分鐘，棄上

清，所得棕黑色沉淀即為粗提線粒體沉淀。

15. 用 10 mL 線粒體重懸液重懸線粒體，4℃ 15000 g 離心 15 分鐘，棄上清。

16. 重復上步一次。

17. 最后用適量的線粒體重懸液重懸線粒體，可用于各種后續(xù)實驗（本試劑盒不提供

相關試劑），如果用于下面的精提操作，則用 10mL 線粒體重懸液重懸。

三：線粒體精提（需要超速離心機）

18. 在跟超速離心機匹配的 50 mL 的離心管中，加入 10 mL 預冷的高比重溶液，再

在上面加上 10 mL 預冷的低比重溶液，最后再加上 10 mL 線粒體粗提液。

19. 70000g 4℃離心 40 分鐘，線粒體將位于高比重溶液和低比重溶液之間區(qū)域。

20. 小心用廣口吸管吸出線粒體到新的離心管中，加入等體積的線粒體重懸液。

21. 用平甩轉子（swinging-bucket rotor）離心機 1000 g 4℃離心 10 分鐘，吸棄

上清，保留線粒體沉淀。

22. 用 10 mL 線粒體重懸液重懸線粒體，在平甩轉子離心機上 4℃ 1000 g 離心 10

分鐘，吸棄上清，保留線粒體沉淀。

23. 再重復上步一次。

24. 最后用適量線粒體重懸液重懸線粒體，得到線粒體精提液?？梢灾苯佑糜?Lowry

法蛋白濃度測定，也可以用于其他后續(xù)實驗。