酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn) 本酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑是一種通過(guò)化學(xué)處理，高效快速制備釀酒酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，用于長(zhǎng)期凍存以備后續(xù)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)品，它具有下列特點(diǎn)：

1. 一次制備，-80℃保存，多次使用，免去每次轉(zhuǎn)化都要制備釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞。

2. 操作簡(jiǎn)單，單溶液制備，除酵母培養(yǎng)的時(shí)間外，整個(gè)操作只需要 30 分鐘

3. 主要用于釀酒酵母 S. cerevisiae，也適用于其他多種實(shí)驗(yàn)用酵母菌株，包括S. pombe、C. albicans、Pichia pastoris 等。

4. 受體酵母可以不含質(zhì)粒，也可用于攜帶有選擇性質(zhì)粒的酵母（如雙雜交體系中的酵母）。

5. 對(duì)釀酒酵母，最高轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到 0.2-1×105個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug 質(zhì)粒 DNA。對(duì)其他酵母，效率稍低，范圍在 100-2000 個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug 質(zhì)粒 DNA。

6. 得到的感受態(tài)細(xì)胞可以用各種線(xiàn)性或環(huán)狀酵母穿梭質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如 YIp, YRp, YCp, YEp 和 YAC 等。

7. 可以用于酵母雙雜交、定點(diǎn)突變（Site－Directed Mutagenesis）、基因破壞（Gene Disruption）、等位突變基因修復(fù)（Mutant Allele Recovery）等實(shí)驗(yàn)。

8. 本產(chǎn)品可以制備 20 只酵母感受態(tài)細(xì)胞（需要 200mL 酵母培養(yǎng)液），并還帶高效轉(zhuǎn)化液。

自備試劑 YPD 培養(yǎng)基
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 小紙盒包裝
酵母化學(xué)感受態(tài)制備液 A 81109a 120 mL
酵母化學(xué)感受態(tài)制備液 B 81109b 6 mL
酵母化學(xué)感受態(tài)制備液 C 81109c 10 mL
酵母化學(xué)感受態(tài)轉(zhuǎn)化液 A 81109a 30 mL
酵母化學(xué)感受態(tài)轉(zhuǎn)化液 B 81109b 30 mL
使用手冊(cè) 81109sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存，有效期一年。 

使用方法 

一：酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備

說(shuō)明：按本方法制備 1 管酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞就需要 OD600 達(dá)到 0.6-1.0 的新鮮酵母培養(yǎng)液 10 mL，用戶(hù)需根據(jù)所需酵母感受態(tài)細(xì)胞的數(shù)量決定培養(yǎng)細(xì)胞的體積。如果超過(guò) 10 mL，則制備液的使用量需要按比例增加。 

1. 挑取酵母受體菌的新鮮的單菌落（4℃放置不超過(guò) 3 周的也可以），接種到裝在 50mL 離心管中的 10 mL 的自備的 YPD 培養(yǎng)基中。

2. 30℃搖晃培養(yǎng)，搖床速度 250 rpm/分鐘，直到 OD600 達(dá)到 0.6-1.0（相當(dāng)于 0.6-1×107細(xì)胞/mL）。

3. 室溫 3000rpm 離心 5 min，棄上清得酵母細(xì)胞沉淀。

4. 新鮮制備適量的酵母感受態(tài)制備工作液。對(duì) 10 mL 酵母需要 5.25 mL的工作液，其配制方法是：將 4.75 mL 酵母化學(xué)感受態(tài)制備液 A、0.25mL 酵母化學(xué)感受態(tài)制備液 B 和 0.25 mL 酵母化學(xué)感受態(tài)制備液 C 加入到一個(gè)無(wú)菌的離心管中后充分震蕩混勻即可。酵母感受態(tài)制備工作液

可放室溫待用。

5. 用 0.5 倍體積的新鮮配制的酵母感受態(tài)制備工作液洗滌酵母細(xì)胞沉淀一次（對(duì) 10 mL 酵母則需要 5 mL 酵母感受態(tài)制備工作液）。即混合后振蕩 1 分鐘，室溫 3000rpm 離心 3 分鐘，去上清得洗滌后的酵母細(xì)胞沉淀。

6. 再用 0.02 倍體積的酵母感受態(tài)制備工作液充分重懸菌體（對(duì) 10 mL酵母，則需要 0.2 mL 酵母感受態(tài)制備工作液）。

7. 按每管 0.2 mL 分裝到冷凍管中，放入保溫冰盒中冷卻半小時(shí)后再放入-80℃冰箱待用。0.2 mL 的感受態(tài)細(xì)胞足夠 1 次轉(zhuǎn)化使用。注意：放入保溫冰盒的目的是使溫度緩慢下降，急凍將使轉(zhuǎn)化效率降低，這點(diǎn)跟大腸桿菌感受態(tài)制備過(guò)程不同。

二：化學(xué)轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

1. 將總體積不超過(guò) 20 uL 的 0.1-5 ug 質(zhì)粒 DNA 加到剛從-80℃冰箱取出的、還處于凝固狀態(tài)的 0.2 mL 酵母感受態(tài)細(xì)胞上。注意：同時(shí)做一個(gè)不加質(zhì)粒 DNA 的陰性對(duì)照組。

2. 室溫充分振蕩直到凝固的感受態(tài)細(xì)胞完全融化。注意：此步非常關(guān)鍵，如果能在恒溫振蕩器上 37℃振蕩 5 分鐘，則效果更好。

3. 加入 1.4mL 酵母化學(xué)感受態(tài)轉(zhuǎn)化液 A，輕柔顛倒混勻一分鐘。

4. 30℃培養(yǎng) 1 小時(shí)。

5. 室溫 3000g 離心 5 分鐘，棄上清。

6. 在酵母細(xì)胞沉淀中加 1.0 mL 酵母化學(xué)感受態(tài)轉(zhuǎn)化液 B，振蕩一分鐘。

7. 室溫 3000g 離心 5 分鐘，棄上清。

8. 在酵母沉淀細(xì)胞中加入適量（如 100 uL）的酵母化學(xué)感受態(tài)轉(zhuǎn)化液 B，混勻后在在選擇培養(yǎng)基上全部涂盤(pán)。

9. 30℃培養(yǎng) 3-5 天后即得酵母轉(zhuǎn)化菌落。