可保種型藍(lán)白T載體
產(chǎn)品及特點 本產(chǎn)品(曾用名:一站式藍(lán)白 T 載體)是環(huán)狀的可以制備藍(lán)白 T 載體的質(zhì)粒 DNA。T 載體是克隆 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的必不可少的工具,但是由于市場上的各種T 載體質(zhì)量參差不齊,用戶很難購買到滿意的產(chǎn)品;同時購買的 T 載體為線性DNA,不能保種,必須反復(fù)購買,累計成本很高。為解決這一問題,基因特推出可保種型 T 載體,用戶只需要購買 Xcm I 內(nèi)切酶就可以自己制備高質(zhì)量的 T載體,隨用隨配,十分方便。
1. 一次購買,終身擁有。本產(chǎn)品提供制備 T 載體用的環(huán)形質(zhì)粒 DNA,可以象其他質(zhì)粒一樣保種并長期保存。
2. 隨用隨配,十分方便。用戶只需要提供 Xcm I 限制性內(nèi)切酶和基本分子生物學(xué)實驗條件,就可以自己制備 T 載體。整個過程只要兩天。
3. T 載體含 T 率為 100。本方法不是使用傳統(tǒng)的加尾法,而是使用 Xcm I 酶切法。質(zhì)粒的多克隆位點上預(yù)先插入了一段長為 1.3 Kb 的 Xcm I DNA 片段,經(jīng) Xcm I 酶切后回收得到的質(zhì)粒 DNA(T 載體)兩端自然全部帶有 T 突出,
比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于用 Taq DNA 聚合酶加尾法和 TdT 加尾法得到的 T 載體。
4. 方便各種下游操作。用本產(chǎn)品得到的藍(lán)白 T 載體插入位點兩側(cè)有多種常見的酶切位點,便于后續(xù)克隆; Xcm I 位點在 Alpha 互補(bǔ)區(qū),可以使用藍(lán)白斑篩選重組子;兩邊還有 T7 和 SP6 RNA 聚合酶啟動子,便于制備 RNA 探針
規(guī)格及成分 成 份 編 號A 型塑料袋包裝B 型塑料袋包裝
藍(lán)白 T 載體(環(huán)狀) LM60803a 50 ng 50 ng
Xcm I (5U/uL) LM60803b 無 20 uL
Xcm I Buffer, 10X LM60803c 無 0.3 mL
使用手冊 60803sc 1 份 1 份
運輸及保存 低溫運輸,-20℃保存,有效期兩年
自備試劑 連接反應(yīng)試劑
使用方法 一. 細(xì)菌的轉(zhuǎn)化
1. 將100 μL感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍。注意:好使用end A1菌種(如DH1、
DH5、DH5?、JM109、XL1-Blue等。常用宿主細(xì)菌的基因型可以參考
《分子克隆手冊》等參考書)。因為這類細(xì)菌所含DNase少,制備T載體后,殘留的DNase對的T末端的破壞機(jī)會更小。
2. 取5-10 μL本產(chǎn)品加入到感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物。在冰上放置30分鐘。
3. 將管放入預(yù)加溫到42℃的水浴中,熱休克90秒??焖賹⒐苻D(zhuǎn)移到冰浴中,使細(xì)胞冷卻1~2分鐘。
4. 每管中加900 μL LB培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)1小時。
5. 取100 μL培養(yǎng)液涂布到含Amp的LB瓊脂平板表面。
6. 將平板置于室溫直至液體被吸收。
7. 倒置平皿,于37℃培養(yǎng),12~16小時后可出現(xiàn)菌落。
二. 細(xì)菌的鑒定
1. 挑取單個菌落進(jìn)行過夜細(xì)菌培養(yǎng)。
2. 按常規(guī)的方法進(jìn)行質(zhì)粒小量制備。
3. 用Xcm I內(nèi)切酶按下面條件酶切提取的質(zhì)粒DNA,如果大規(guī)模酶切,需要
按比例增加各成分用量:
成分 使用量
Xcm I Buffer, 10X 5 uL
質(zhì)粒DNA <或= 2 ug
Xcm I 1 uL
超純水 加到50uL
37℃保溫一小時, 65℃保溫20分鐘使酶失活。
4. 電泳,本產(chǎn)品被Xcm I酶切后將產(chǎn)生3 Kb和1.3 Kb的兩段DNA。
5. 如果Xcm I酶切圖譜正確,則按常規(guī)的方法進(jìn)行細(xì)菌的保種(詳見分子克隆手冊等參考書)。
三. T載體的制備
1. 參考《分子克隆手冊》等參考書培養(yǎng)細(xì)菌和提取質(zhì)粒DNA。注意:一定要去盡可能去除殘留的RNA和蛋白質(zhì)(含殘留DNase)的污染。
2. 用Xcm I酶切質(zhì)粒。注意:酶切時間好不要超過一小時,避免殘留的DNase對T末端的破壞。
3. 電泳后切下含3Kb DNA(既藍(lán)白T載體)的膠段。注意:千萬不要用UV照射將要回收的片段,因為UV會使DNA交連,使DNA失去轉(zhuǎn)化細(xì)菌的能力。如果酶切的DNA量大,可以使用基因綠如藍(lán)核酸染料,可以直接在可見光和黑背景下切膠。如果別無選擇,好在長波(360nm)紫外燈下快速切膠,盡可能切掉多余的凝膠。為避免DNA交連,可以使用基因的DNA防護(hù)劑UV Erasol(CAT#:60601)
4. 用常規(guī)DNA回收方法進(jìn)行膠回收。
5. 測定T載體DNA的濃度后,將T載體DNA保存在-20℃?zhèn)溆没蛑苯邮褂谩?/p>
四. 連接反應(yīng)
1. 短暫離心裝有T載體的離心管。
2. 在兩個離心管中加入下列成分:
成份 樣品管 陰性對照管
T4 Ligase Buffer,10X 1 uL 1 uL
藍(lán)白 T 載體 20-50 ng 20-50 ng
PCR 純化產(chǎn)物 50-500 ng 不加
T4 Ligase 3-5 U 3-5 U
補(bǔ)水到 10 uL 10 uL
注意: PCR純化產(chǎn)物與藍(lán)白T載體的摩爾比好為3:1-10:1。
3. 用移液器吹打連接反應(yīng)使之混勻后,16℃孵育12小時(或按T4 Ligase供貨商提供的操作手冊進(jìn)行連接)。
五. 細(xì)菌轉(zhuǎn)化和鑒定
1. 取5 μL連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化,具體步驟見本手冊一,好使用含X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板以便進(jìn)行藍(lán)白篩選。
2. 按經(jīng)典的質(zhì)粒提取+酶切或測序鑒定,可以選用的、在插入位點兩側(cè)都有酶切位點的酶有BstZ I、EcoR I和Not I。可以使用pUC/M13 Forward和Reverse測序引物測定插入片段的序列。按菌落PCR方法篩選,可選用基因的菌落PCR試劑盒(CAT#:50901)進(jìn)行快速篩選,需要T7和SP6 RNA聚合酶啟動子引物。
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