T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn) 本試劑盒是基于 T7 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，它利用含有 T7 啟

動(dòng)子的模版 DNA，以 NTP 為底物，從 T7 啟動(dòng)子下游開始合成與模版 DNA 中一條鏈互補(bǔ)的 RNA，簡(jiǎn)單快速獲得大量的 RNA 分子。本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需提供含 T7 啟動(dòng)子的 DNA 模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，

不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每一個(gè)成份。

2. 單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。

3. 模版 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

4. 可以合成的 RNA 的長(zhǎng)度在 20nt 到 2000 nt 之間。

5. 產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化，每 ug DNA 模版可以合成 2-6 ug RNA。

6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結(jié)構(gòu)研究、核酶生物化學(xué)、體外翻譯、RNA-蛋白

質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實(shí)驗(yàn)。

7. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，并且只能用于科研。
規(guī)格及成分 成份 編號(hào) 十孔盒包裝
T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液，2× 91106a 0.5 mL（綠色蓋）
T7 RNA 聚合酶-RI 混合液 91106c 50 μL（黃色蓋）
RNase-free 水 80403 1 mL（亮黃蓋）
使用手冊(cè) 91106sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存、有效期一年。

自備試劑 Tris 飽和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇(均可從本公司另購(gòu)) 

相關(guān)資料 一、制備 DNA 模板（本試劑盒不含所需試劑，此處信息僅供參考）

PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點(diǎn)。

一是必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切

酶切成線狀。

二是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的上游必須有 T7 啟動(dòng)子。如果模板是 PCR 產(chǎn)物，則

可以在設(shè)計(jì)引物時(shí)將 T7 啟動(dòng)子序列（5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG

3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T7 啟動(dòng)子的載體，

并且克隆位點(diǎn)必須位于 T7 啟動(dòng)子下游。

三是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端不要是 3’突出。如果是 3’突出（比如

選擇了 Pst I 來線性化質(zhì)粒），則用 T4 DNA 聚合酶修平。

四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質(zhì)粒 DNA 的過程中一般要使

用大量的 RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的 RNase A 污染，所以在用作

模板前，采取膠回收得方法回收質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總 RNA 一起保溫，

然后電泳檢測(cè) RNA 是否被降解，以此來判斷純化的 DNA 模板是否有殘留 RNase

A。如果有 RNase 污染，則必須反復(fù)酚-氯仿抽提去除殘留的 RNase，然后再乙

醇沉淀質(zhì)粒 DNA。

二、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

1. 如果有 N 個(gè)樣品，強(qiáng)烈建議做一個(gè)陰性對(duì)照，故共設(shè)置 N+1 個(gè)反應(yīng)，這樣一

起并排電泳時(shí)容易判斷哪個(gè)條帶是模板 DNA，哪個(gè)條帶是擴(kuò)增得到的 RNA。

在 N+1 個(gè) RNase-free 的塑料離心管中，在室溫下（不是在 4℃下）按次序

加入下列成分（T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液容易產(chǎn)生結(jié)晶沉淀，一定要握在手中直到結(jié)晶

徹底溶解并搖勻后方可使用）：

成分 N 個(gè)樣品管 陰性對(duì)照管

DNA 模板 50 ng 左右的 PCR 片段

或 1 ug 左右的線狀質(zhì)粒 不加

T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液，2× 各 10 μL 10 μL

T7 RNA 聚合酶-RI 混合液 各 1 μL 1 μL

補(bǔ) RNase-free 水到 20μL 20μL

注：此為 20μL 反應(yīng)體系的用量，對(duì)其他反應(yīng)體系，各成分的用量可以按比例

增減。本產(chǎn)品的 T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液已經(jīng)含有 NTP。如果需要標(biāo)記 RNA 探針或制備

帶帽 RNA，則需要訂購(gòu) NTP 分開的試劑盒。

2. 37℃保溫 1-2 小時(shí)。注意：延長(zhǎng)保溫時(shí)間并不能大幅提高產(chǎn)量。

3. 加入 2μL 自備的 500mM 的 EDTA 溶液滅活 T7 RNA 聚合酶。

4. 取 1-3 μL 電泳，此時(shí)用 DNA 模板做電泳對(duì)照。電泳時(shí)比陰性對(duì)照多出

的條帶就是擴(kuò)增得到的 RNA（由于合成的 RNA 長(zhǎng)度不均勻，即使長(zhǎng)度均勻，

但由于自生形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，泳動(dòng)速度也不一致，所以電泳所得 RNA 條帶一般

都不是清晰，而是比較彌散的電泳條帶。但由于 RNA 是單鏈，分子量比同樣

長(zhǎng)度的 DNA 小一倍，因此 RNA 一般比其雙鏈 DNA 模板電泳速度更快。

5. 定量，可以用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒檢測(cè)濃度。不推薦使用電泳定量。

使用本試劑盒時(shí) 1μg DNA 模板一般可以合成 2-6μg 的 RNA。

6. 得到的 RNA 可以放-80℃保存。如需去除 DNA 模板，請(qǐng)按下面步驟操作。

三、去除 DNA 模板（所需試劑需要另購(gòu)）

7. 在 20μL 體積的體外轉(zhuǎn)錄體系中加入 2μL 的 10×DNase Buffer 和 1 μL 自

備的 RNase-free DNase（3-5 U/μL）。

8. 37℃保溫 30 分鐘。

9. 補(bǔ) RNase-free 水到 100 μL。增加體積可以減少樣品的丟失。

10. 用自備的等體積（100 μL）的 Tris 飽和酚-氯仿，震蕩混勻后 14000g 離心

3 分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。此步去除 DNase 和 RNA 聚合酶。

11. 加自備的 200 μL 無水乙醇和 10μL 3M 的乙酸鈉溶液（pH5.2），振蕩后14000 rpm 離心 20 分鐘，RNA 形成沉淀，棄上清。

12. 在沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 14000g 離心 5 分鐘，棄上清。

13. 短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。不要丟失沉淀。

14. 晾干，所得沉淀即體外轉(zhuǎn)錄所得的 RNA。