即用型易錯(cuò)PCR試劑盒

產(chǎn)品特點(diǎn)：制突變PCR易錯(cuò) PCR（error-prone PCR）是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校對(duì)功能的特性，在一定條件下（如不同的 dNTP 濃度、Mg 濃度和 MnCl2存在）能夠按較高的機(jī)率引入隨機(jī)引入突變。如果有適當(dāng)?shù)倪x擇方法，則可從構(gòu)建的突變庫(kù)選出所需突變體。易錯(cuò) PCR 和常規(guī) PCR 的比較如下：本產(chǎn)品就是專門為廣大的研究工作者進(jìn)行易錯(cuò) PCR 而開發(fā)，本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，十分簡(jiǎn)單方便，尤其在生物制藥和酶學(xué)研究領(lǐng)域顯示出了它的優(yōu)越性。

2. 配方經(jīng)過精心優(yōu)化，突變率穩(wěn)定，突變沒有趨向性。易錯(cuò) PCR 的突變率為 0.66%（±0.13%），詳見使用手冊(cè)疑難解答。

3. 比體內(nèi)基因突變更快捷簡(jiǎn)單，但如果在 PCR 引物中設(shè)計(jì)位點(diǎn)，則可使產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體，也可以用于體內(nèi)蛋白活性的篩選。

4. 可用于連續(xù)易錯(cuò) PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易錯(cuò) PCR 的產(chǎn)物用作下一次易錯(cuò) PCR 的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。

5. 只適用于擴(kuò)增 1kb 以下的產(chǎn)物，對(duì)于 1kb 以上的產(chǎn)物，建議分段擴(kuò)增。

6. 本產(chǎn)品足夠 100 次 30uL 體系的易錯(cuò) PCR 反應(yīng)，只能用于科研。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 十孔盒包裝
易錯(cuò) PCR Mix，10× LM101005a 300 uL（白蓋）
易錯(cuò) PCR 專用 dNTP，10× LM101005b 300 uL（綠蓋）
易錯(cuò) PCR 專用 MnCl2 LM160903c 300 uL（黃蓋）
易錯(cuò) PCR 專用
Taq DNA 聚合酶（5U/uL）
101005c 50 uL（紅蓋）
使用手冊(cè) 101005sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 有效期為一年。 

自備試劑 引物、DNA 模板、超純水。

使用方法 1. 將自備的 PCR 引物稀釋到 10uM。引物也是決定易錯(cuò) PCR 成敗的關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)引物時(shí)要保證其 Tm 在 70℃，長(zhǎng)度在 25-30nt 之間，GC 含量在 45%-60%之間，3端 GC 含量低，并且沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。用自備引物和常規(guī) PCR 試劑擴(kuò)增制備易錯(cuò) DNA 模板（常規(guī) PCR 產(chǎn)物），膠回收并準(zhǔn)確確定濃度。注意：易錯(cuò) PCR 的模板一定要用膠回收的常規(guī) PCR 產(chǎn)物，因?yàn)槟z回收會(huì)可以把電泳不可見的非特異性擴(kuò)增片段去除，否則這些片段由于也是用易錯(cuò) PCR引物擴(kuò)增所得，在易錯(cuò) PCR 擴(kuò)增時(shí)也會(huì)被擴(kuò)增，產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制，降低靶分子的擴(kuò)增效率。如果常規(guī) PCR 制備模板的引物和易錯(cuò) PCR 引物不同（類似巢式 PCR）則可以避免此問題，但需要合成兩對(duì)引物。本試劑盒只適用于擴(kuò)增 1kb 以下的產(chǎn)物，對(duì)于1kb 以上的產(chǎn)物，建議分段擴(kuò)增。

2. 將回收的 DNA 片段（模板）稀釋到 1ng/uL 、10ng/uL 和 100ng/uL 三個(gè)濃度。

注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素，模板 DNA 為非突變 DNA，擴(kuò)增產(chǎn)生的 DNA 為突變 DNA，易錯(cuò) PCR 體系最終 DNA 量是基本固定的，因此模板 DNA 使用量越大，則突變 DNA 在終產(chǎn)物中的相對(duì)比例就越低，突變率就越低。反之亦然。但模板太少又不容易擴(kuò)增成功，所以建議同時(shí)測(cè)試三個(gè)模板用量。如果都成功，則優(yōu)先選用模板濃度低的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析。

3. 以 30 uL 的標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)體系為例，如果反應(yīng)體系不是 30 uL，各成分需要等按比例增加或減少。在一干凈的 PCR 管中，加入下列成分：成分 模板用量 1 模板用量 2 模板用量 3

易錯(cuò) PCR Mix, 10× 3 uL 3 uL 3 uL

自備 DNA 模板 1 uL（1ng/uL）1 uL（10ng/uL）1 uL（100ng/uL）

易錯(cuò) PCR 專用 dNTP,10×3 uL 3 uL 3 uL

易錯(cuò) PCR 專用 MnCl2 3 uL 3 uL 3 uL自備易錯(cuò) PCR 引物(10 uM each)各 1 uL 各 1 uL 各 1 uL

易錯(cuò) PCR 專用 Taq

DNA 聚合酶（5U/uL）

0.5 uL 0.5 uL 0.5 uL

補(bǔ)自備超純水到 30 uL 30 uL 30 uL

4. 按用戶已經(jīng)優(yōu)化的 PCR 條件進(jìn)行一定循環(huán)數(shù)的 PCR（循環(huán)數(shù)與突變率的關(guān)系見下表），然后取 10uL 電泳檢查。如果沒有優(yōu)化的 PCR 條件，一般可以先嘗試下面的PCR 條件(注意：易錯(cuò) PCR 一般不需要熱啟動(dòng)，也不需要在 PCR 結(jié)束后做延伸處理)：

步驟 參數(shù) 循環(huán)數(shù)

PCR 前變性 94℃ 3 分鐘 循環(huán) 1 次

易錯(cuò) PCR

94℃ 1 分鐘

45℃ 1 分鐘 循環(huán) 30-60 次

72℃ 1 分鐘

注：易錯(cuò) PCR 一般不需要熱啟動(dòng)，也不需要在易錯(cuò) PCR 結(jié)束后做延伸處理。易錯(cuò) PCR

循環(huán)次數(shù)越多，突變 DNA（擴(kuò)增產(chǎn)物）與非突變 DNA（原始模板）的比例就越高。此外

在突變率和模板長(zhǎng)度恒定的情況下，擴(kuò)增次數(shù)越多，發(fā)生突變的數(shù)就越高，在同一模

板上發(fā)生的突變位點(diǎn)數(shù)就越多，所以如果需要，可以做 30、35、40、45、50、55、60

次 7 個(gè)循環(huán)數(shù)的比較。

5. 電泳檢測(cè)是否得到預(yù)計(jì)長(zhǎng)度的 PCR 產(chǎn)物。如果沒有，可以調(diào)整模板用量和 PCR 參數(shù)。

6. 膠回收易錯(cuò) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物、克隆并對(duì)單菌落進(jìn)行功能篩選或測(cè)序分析、如果需要增加突變率，可以以突變后的 DNA 為模板，進(jìn)行下一輪易錯(cuò) PCR。