一站式DNA非變性PAGE電泳套裝

產(chǎn)品及特點非變性 PAGE 電泳是研究 SSCP-PCR（single-strand conformationpolymorphism-PCR、單鏈 PCR 片段構(gòu)象多態(tài)性）和凝膠滯阻（Gel Shift）的重要研究手段，因為在非變性 PAGE 中，DNA 的遷移率除跟長短相關(guān)外，還跟其構(gòu)象和結(jié)合的蛋白質(zhì)相關(guān)。本產(chǎn)品就是專門用于非變性 PAGE 的試劑，它具有下列特點:

1. 一站式，用戶只需要準備去離子水和樣品，十分方便。

2. 安全，免去了實驗人員接觸粉末狀的劇毒物品丙烯酰胺。

3. PAGE 電泳后可直接用于銀染等后續(xù)試驗。\
規(guī)格及成分 成份 編號 大紙盒包裝 
保存 丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺 （29:1） 100876 60 g（250mL 棕色 塑料瓶） 常溫 TEMED 100880 1.5 mL（棕色管） 常溫 過硫酸銨（干粉） 100879 1 g 常溫 DNA 非變性 PAGE 上樣液 100875 1.5 mL -20℃ 10×TBE 90313 250 mL 常溫 使用手冊 100205sc 1 份 常溫
注：TEMED 和過硫酸銨（干粉）放一個熱封袋，DNA 非變性 PAGE 上樣液 放另一個熱封袋，低溫單獨存放。 

運輸及保存 常溫運輸，收到貨后各成分的保存條件見上表，有效期一年。

自備試劑 去離子水、核酸銀染試劑盒

使用方法 用于 SSCP-PCR 分析的非變性 PAGE 電泳（其他應用請相應修改參數(shù)）

一、PAGE 濃度的選擇：好使用濃度為 5-12%的丙烯酰胺膠，因為SSCP-PCR 的擴增長度一般在 150-200bp 之間，而 5%的 PAGE 的有效分辨范圍為 80-500bp、8%的 PAGE 的有效分辨范圍為 60-400bp、12%的 PAGE 的有效分辨范圍為 40-200bp。

二、體積的選擇：SSCP-PCR 檢測需要長約 30-40cm 的測序膠板，可以結(jié)合梳子的厚度，計算所需 PAGE 膠的體積。

操作：

1. 配制 PAGE 膠（下面以配制 100 mL PAGE 膠為例計算用量，配制更大體積的膠則需以此用量為基礎(chǔ)按比例增加）

A：新鮮配制 10%的 APS（過硫酸銨）：按每 0.1 克過硫酸銨干粉加 1mL去離子水的比例將水加到裝有硫酸銨干粉的 1.5 mL EP 管中，搖晃到粉末全部溶解。配制好的 10%的 APS 溶液可以在 4℃存放一周。

B：新鮮配制 30%的丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液（29:1 的 AB 溶液，下同）：在本產(chǎn)品提供的裝有 60g 丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺干粉的250mL 棕色塑料瓶中加入 146 mL 自備的去離子水，充分搖晃直到溶解（約需 10-20 分鐘），即得到 30%的 AB（29:1）溶液。此溶液好在一個月內(nèi)用完，4℃保存。

C：配 SSCP PAGE 膠：在一個 250mL 的三角瓶中，先按下表的用量加入去離子水、30% AB 溶液和 10×TBE 緩沖液。丙烯酰胺單體溶液具有神經(jīng)毒性，一定要戴手套操作。

C：搖晃混勻。好能抽真空 10-15 分鐘以去除溶液中的氧氣（氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應），無條件也可以不脫氧。

D：加入 500uL 10%APS 和 100uL TEMED，迅速搖勻后倒膠。

E: 在膠的液面距離達到頂部時停止灌膠，插入梳子。

F: 室溫聚合 30-60 分鐘（低溫抑制聚合反應，故好室溫）。

G: 待膠凝固后拔出梳子，用 1×TEB 液沖洗加樣孔。

H: 放 4℃冰箱預冷 30 分鐘-12 小時。為了防止 PAGE 膠收縮，好在其頂部加少量 1×TBE 緩沖液。使用預冷的 PAGE 膠有利于單鏈 DNA 在電泳時保持其構(gòu)型，這些構(gòu)型靠 DNA 序列間的鏈內(nèi)互補形成，對溫度很敏感。

2. 將預冷的凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入足夠 1×TEB 電泳液。

3. 取 3-5 uL SSCP-PCR 樣品，加入等體積 2×非變性 PAGE 上樣液，85℃處理 5 分鐘后冰浴。用前短暫離心后取 2 uL 上樣。上樣量跟檢測方法的靈敏度相關(guān)，上述上樣量是針對核酸銀染檢測法。

4. 連接電源線，打開電源開關(guān)。如果 PAGE 中不含甘油，則使用 25W 的功率，電泳 5-7 小時（對 3-40cm 長的 PAGE 膠而言）。如果使用含甘油的PAGE，則使用 8W 的功率，電泳 16-18 小時。由于溫度變化過大會改變DNA 構(gòu)型，所以電泳時好能保持恒溫。對不含甘油的 PAGE，好恒溫在 4℃、對含甘油的 PAGE，好恒溫在 25℃。

5. 終止電泳，取出凝膠進行后續(xù)的銀染處理。不建議使用靈敏度低于銀染的方法，因為 SSCP 異構(gòu)體的數(shù)量都比較少，一般方法沒法檢測到。