DNA磷酸化試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn) 人工合成的 PCR 引物、linker 和 adaptor 的 5′端一般都是-OH 基團(tuán)而不是-PO4 基團(tuán)（除非額外付費(fèi)要求在人工合成時(shí)加上-PO4 基團(tuán)），而任何 DNA 連接酶都不能將一個(gè) DNA 分子 5′端的-OH 基團(tuán)和另一個(gè) DNA 分子 3′端的-OH 基團(tuán)進(jìn)行連接，因此通過人工合成的 DNA 片段和天然 DNA 之間的連接效率一般都比天然 DNA 彼此的連接效率低（天然 DNA 4 個(gè)端口均可連接，人工合成的 DNA 跟天然 DNA 有 2 個(gè)端口可以連接，人工合成的 DNA 之間沒有任何端口可以連接），尤其是在平末端連接時(shí)。本公司開發(fā)的 DNA 磷酸化產(chǎn)品能將 DNA 分子 5′端的-OH基團(tuán)磷酸化。它具有下列特點(diǎn)：

1. 可以快速把 DNA 5′端的-OH 基團(tuán)變成-PO4 基團(tuán)，使人工合成的 DNA（包括PCR 產(chǎn)物）跟天然 DNA 一樣有高的連接效率。

2. 既可以對單鏈 DNA 進(jìn)行磷酸化處理，也可以對雙鏈 DNA 片段同時(shí)磷酸化處理。

3. 處理后的 DNA 可以直接用于連接反應(yīng)、克隆等，不需要純化。

4. 本產(chǎn)品足夠 20 次 DNA 的磷酸化實(shí)驗(yàn)。

DNA磷酸化試劑盒運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期為 6 個(gè)月。

自備試劑 引物、PCR 產(chǎn)物、DNA 片段

使用方法 

一：雙鏈 DNA 片段（5’端為-OH 基團(tuán)的）的磷酸化

注意：如果是 PCR 產(chǎn)物，一定要先膠回收，不能使用沒經(jīng)過純化的 PCR 反應(yīng)液，因?yàn)槠渲械臍埩?PCR 引物會耗掉大量的激酶，降低 PCR 產(chǎn)物的磷酸化效率。

1、在微量離心管中配制下列反應(yīng)液（20μL）：成 分 用 量

PCR 膠回收片段 2 μL（不超過 10 pmol）

10×TPK 緩沖液 2 μL

ATP 溶液（10 mM） 5 μL

T4 多核苷酸激酶（10U/uL） 1 μL

超純水到 20 μL

2、37℃反應(yīng) 30 分鐘。

3、70℃熱處理 5 分鐘，滅活酶。

4、可直接用于后續(xù)克?。尤肓坎灰^總體積的 1/5）。

二：單鏈 DNA 片段的磷酸化

注：單鏈 DNA 包括局部雙鏈的 DNA。引物，linker，adaptor，Oligo 探針等均按此操作處理。

5、在微量離心管中配制下列反應(yīng)液（20μL）：成 分 用 量

單鏈 DNA 片段 5-10 pmol

10×TPK 緩沖液 2 μL

ATP 溶液（10 mM） 1 μL

T4 多核苷酸激酶（10U/uL） 1 μL

超純水到 20 μL

6、37℃反應(yīng) 30 分鐘。

7、70℃熱處理 5 分鐘，滅活激酶。

8、可直接用于后續(xù)克?。尤肓坎灰^總體積的 1/5）。如果使用濃度高，則可能需要乙醇沉淀法濃縮 DNA。如果單鏈 DNA 的濃度低于 5pmol，還需要在乙醇沉淀時(shí)加入核酸助沉劑。沉淀得到的 DNA 可溶解在適量的水中。附：乙醇沉淀濃度 DNA(本試劑盒不提供相關(guān)試劑，下列操作僅供參考_：

1、在 DNA 溶液中加入 0.1 倍體積的 3 M 乙酸鈉溶液（pH 5.2），

2、再加入 2.5 倍體積的無水乙醇和 4uL 核酸助沉劑。

3、混勻后 12000g 4℃離心 10 分鐘，小心棄上清。

4、加入 1mL 70%乙醇，短暫離心 3 分鐘后小心棄上清。

5、短暫離心 5 秒，吸棄殘留液體（約 30-50uL）。

6、室溫放置 2 分鐘干燥后加入適量的超純水溶解 DNA，立即使用或放-20℃長期保存。