革蘭氏陽性細菌質粒DNAout
產(chǎn)品及特點 本試劑盒是用于從革氏陽性（G+）細菌種小量制備質粒 DNA。本產(chǎn)品基于改良后 的堿變性法，首先菌體經(jīng)溶菌酶破壁，然后堿裂解法處理使基因組 DNA 和質粒 DNA 均變性，再用酸中和，質粒 DNA 客戶快速復性，而基因組 DNA 不能快速復性，故 可以通過離心去除，除去后含質粒的上清用離心吸附柱吸附質粒 DNA，洗去雜質， 即可得到純化的質粒 DNA。本產(chǎn)品具有下列特點：
1. 快速、步驟少，整個操作在 40 分鐘左右完成。
2. 不需要預平衡離心吸附柱。
3. 通用洗柱液即開即用，不需要用戶額外加乙醇。
4. 溶液 B 中有藍色染料，便于目測非常關鍵的堿變性和中和反應兩步的溶液混勻狀 況，保證實驗效果。
5. 產(chǎn)量高，一次可以處理 1-4 mL 過夜培養(yǎng)的 G+菌液，每毫升過夜培養(yǎng)的 G+細 菌可以提取到 2-5 ug/mL（取決于質粒是高拷貝、中拷貝還是低拷貝）。
6. 純度高，采用本試劑盒提取的質粒 OD 比值在 1.8-2.0 之間，可以直接用于酶切、 轉化、測序及 PCR 等。 
革蘭氏陽性細菌質粒DNAout
規(guī)格及成分 成 份 編 號 大紙盒包裝
革氏陽性質粒 DNAout 溶液 A 120601a 13 mL
革氏陽性質粒 DNAout 溶液 B 120601b 13 mL
革氏陽性質粒 DNAout 溶液 C 120601c 18 mL
溶菌酶干粉（20KU/mg） 80103c 30mg(黃蓋)
RNase A 溶液,10mg/mL 3160 0.6 mL
通用洗柱液 60408 50 mL
DNA 洗脫液 2.0 111205 10 mL
離心吸附柱 60911 50 套
使用手冊 60205sc 1 份
革蘭氏陽性細菌質粒DNAout運輸及保存 常溫運輸和保存，RNase A 溶液需要-20℃保存，有效期一年。 自備試劑 無 
使用方法 1. 從篩選平板上挑取單菌落至含抗生素的培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng) 12-16 小時（搖 床轉速 200-300）。注意：建議使用 LB 培養(yǎng)基，營養(yǎng)更豐富的培養(yǎng)基會使菌體 濃度過高，超過純化系統(tǒng)處理能力而降低 DNA 質量。另外，延長培養(yǎng)時間會因 細胞死亡、裂解而造成質粒 DNA 濃度降低。
2. 用 1.5 mL 離心管收集 1-4 mL 過夜培養(yǎng)飽和菌液，室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘，棄上清，再短暫離心，吸棄殘留液體。
3. 次使用本試劑盒時，先將全部 RNase A 溶液全部加入到革氏陽性質粒 DNAout 溶液 A（簡稱溶液 A，下同）中，搖勻后再取用，未用完的溶液 A 放 4℃ 保存。
4. 加入 250 uL 溶液 A，用槍頭充分吹打使菌體重懸。注意：細胞未充分懸浮會影 響后續(xù)堿變性，可以使用漩渦振蕩器混勻或使用槍頭吸頭吹打沉淀至完全混勻。
5. 加入大約 5 mg 溶菌酶干粉（用 0.1mg 精度的分析天平稱量），輕柔顛倒混勻后 室溫放置 10 分鐘破裂細胞壁。
6. 加入 250 uL 革氏陽性質粒 DNAout 溶液 B（下面簡稱溶液 B，如果溶液 B 在 低溫放置產(chǎn)生沉淀，須 37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用），溫和反復顛倒混 勻看到溶液的藍色變得均勻并且溶液變粘即可（一般需要顛倒 4-6 次），然后冰 上放置不超過 5 分鐘。注意：冰上放置不要超過 5 分鐘，否則質粒 DNA 會有堿 損傷。千萬不要劇烈振蕩，否則基因組 DNA 斷裂產(chǎn)生的片段非常容易污染質粒 DNA。溶液 B 用后需要將蓋擰緊存放，否則空氣中的二氧化碳會進入溶液，形 成碳酸，中和溶液 B 中的堿，降低其效率。如果溶液 B 顏色不是藍色，則表示 變質，應該棄之不用并且速跟廠家聯(lián)系。
7. 加入 350 uL 冰上預冷的革氏陽性質粒 DNAout 溶液 C（下面簡稱溶液 C），溫 和反復顛倒直到溶液顏色變成無色（一般需要顛倒混勻 4-6 次）?；靹蚝罂梢姲?色沉淀物產(chǎn)生，然后冰上放置至少 5 分鐘讓質粒 DNA 復性。
8. 12,000 rpm 離心 3 分鐘，小心將上清液轉移到離心吸附柱中。由于此時的溶液 比重較大，部分沉淀物懸浮在上清液中屬正常，吸取上清時避開漂浮的沉淀物即 可。如果此步的離心在 4℃進行，可減輕沉淀物漂浮。
9. 靜置 2 分鐘以讓質粒 DNA 與離心吸附柱充分結合，保證靜置不少于 2 分鐘十分 重要。
10. 室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘，棄收集管中的廢液。
11. 加入 500 uL 的通用洗柱液到離心吸附柱中，室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘， 棄收集管中廢液。注意：通用洗柱液中含乙醇，每次用后需要將蓋擰緊存放，否 則乙醇會揮發(fā)。
12. 重復上步 1 次。
13. 室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘，甩干殘留液體。此步不能省略，否則殘留乙醇 會影響 DNA 的后續(xù)使用（如殘留乙醇使 DNA 溶液在電泳上樣時不能沉淀到加 樣孔中）。
14. 將離心吸附柱置于一個新的 1.5 mL 塑料離心管（自備）中，加入 30-100 uL 65-80℃預熱的 DNA 洗脫液 2.0，室溫放置 2 分鐘。常溫的 DNA 洗脫液 2.0 也可以用于洗脫，但產(chǎn)量稍微有所降低。
15. 室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘，離心管底溶液即質粒 DNA。
16. 由于基因的吸附柱結合 DNA 能力較強，如果再加適量 DNA 洗脫液 2.0 到 離心吸附柱中，往往還能洗脫下很多質粒 DNA（相當于次洗脫的 20-30%）， 但注意不要使用上步得到的 DNA 洗脫液 2.0 來洗脫。