產(chǎn)品簡(jiǎn)介
BCA蛋白濃度檢測(cè)是一個(gè)實(shí)驗(yàn),是根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度.堿性條件下,蛋白將Cu2+還原為Cu+, Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物,測(cè)定其在562nm處的吸收值,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比,即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。
常用濃度的去垢劑SDS,Triton X-100,Tween不影響檢測(cè)結(jié)果,但受螯合劑(EDTA,EGTA)、還原劑(DTT,巰基乙醇)和脂類的影響。實(shí)驗(yàn)中,若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高,可試用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒。
操作說明
一. 微孔酶標(biāo)儀法
1. 配制工作液:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,按50體積 BCA試劑A 加1體積 BCA試劑B(50:1)配制成 BCA工作液,充分混勻 (混合時(shí)可能會(huì)有渾濁,但混勻后就會(huì)消失)。BCA 工作液室溫24 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品:取 10μL BSA 標(biāo)準(zhǔn)品用 PBS 稀釋至 100μL(樣品一般可用 PBS 稀釋),使終濃度為 0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 μL加到 96 孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中,加 PBS 補(bǔ)足至 20μL。
3. 將樣品作適當(dāng)稀釋(多做幾個(gè)梯度,如作 2 倍、4 倍、8 倍稀釋),加 20μL到 96 孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量樣品時(shí)誤差偏大,標(biāo)準(zhǔn)線前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確,所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線 1/2 后。
4. 各孔加入 200μL BCA 工作液,37℃放置 15-30 分鐘。用酶標(biāo)儀測(cè)定 A562nm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。使用溫箱孵育時(shí),應(yīng)注意防止因水分蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果。
二. 分光光度計(jì)法
如沒有酶標(biāo)儀,可用分光光度計(jì)在離心管中混勻后加入比色皿中比色。
步驟如下:
1. 配制工作液: 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,按50體積 BCA試劑A 加1體積 BCA試劑B(50:1)配制成 BCA工作液,充分混勻 (混合時(shí)可能會(huì)有渾濁,但混勻后就會(huì)消失)。BCA 工作液室溫 24 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品:取 100μL BSA 標(biāo)準(zhǔn)品用 PBS 稀釋至 1ml(樣品一般可用 PBS 稀釋),使終濃度為0.5mg/ml。
3. 取八支(或者更多)5ml 離心管,標(biāo)上號(hào),按下表加入試劑。
4. 37℃放置 15-30 分鐘。用分光光度計(jì)測(cè) 562nm 處吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。
注意事項(xiàng):
1. 長(zhǎng)期不用時(shí),BCA試劑B與PBS 稀釋液可置于 2-8℃保存,如發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染則應(yīng)丟棄。BCA試劑A在低溫條件下出現(xiàn)結(jié)晶沉淀時(shí),可 37℃溫育使其完全溶解, 不影響使用。
2. 樣品中若含有較多干擾物質(zhì)時(shí),請(qǐng)采用 Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒。
3. 待測(cè)蛋白溶解于什么樣的稀釋液中,蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中,否者待測(cè)蛋白不蛋白標(biāo)準(zhǔn)中所含非蛋白成分不一致,有可能導(dǎo)致測(cè)定不準(zhǔn)確。
4. 待測(cè)蛋白和蛋白標(biāo)準(zhǔn)加入 BCA 工作液后,如果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)效果不佳,可以室溫放置 2h或 60℃放置 30min,顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深。顯色反應(yīng)也會(huì)隨溫度升高而加快。如果濃度較低,可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間或在較高溫度下孵育。
5. 為了加快 BCA 法測(cè)定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)加熱,但是切勿過熱,否則易失效。
6. 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
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