概述

得益于高通量測序技術和生物信息學的發(fā)展，研究人員已經(jīng)可以在較短時間內(nèi)完成整個基因組測序工作。然而，如何快速高效的實現(xiàn)基因功能研究，仍然面臨很大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)基因功能的篩查方法主要通過RNA干擾技術（RNAi）在后轉錄水平實現(xiàn)基因表達的敲低。近期，已有報道利用在鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng) 成功實現(xiàn)了哺乳動物基因組的定點編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種由RNA引導Cas9蛋白對靶基因進行修飾的技術。將該系統(tǒng)中的Cas9酶或經(jīng)遺傳修飾的Cas9酶與基因組規(guī)模的gRNA文庫相結合，可實現(xiàn)全基因組的基因敲除或基因轉錄調節(jié)，用于各種高通量篩選。例如在正向篩選中，可以用來篩選哪些基因的突變引起細胞對藥物、毒素、病原體等產(chǎn)生耐受性。一個最簡單的例子是，當細胞轉入Cas9-gRNA文庫后，加入炭疽毒素處理，存活下來的細胞即是基因突變引起對炭疽毒素的耐藥性，利用高通量測序分析毒素處理前后gRNA豐度變化，即可確定發(fā)生突變的基因。在負向篩選中，該系統(tǒng)可用于確定哪些基因對不同的處理方式更為敏感。一個最簡單的例子是，當細胞轉入Cas9-gRNA文庫后，比較存活時間不同的細胞中gRNA豐度，存活時間短的細胞中，由gRNA-Cas9引起突變的基因很可能是與細胞增殖相關。負向篩選一個很重要的用途是用來確定不同狀態(tài)的癌細胞中存在哪些致癌基因的突變，這些突變的基因很可能成為癌癥治療的靶點。CRISPR/Cas9技術使基因編輯變得更為便捷并且高效。與高通量測序相結合，不但可以使研究者快速高效地得到一些實驗結果，也拓寬了這一技術的應用范圍。例如，在藥物開發(fā)中可用于快速發(fā)現(xiàn)藥物的靶標并進行有效、直觀的驗證。這對探究藥物的藥理、毒理或細胞的抗藥機理提供了巨大幫助。再如，美國科學家等利用這一技術在非小細胞肺癌（NSCLC）小鼠模型的細胞中，系統(tǒng)地敲除整個基因組的所有基因，隨后將這些細胞移植到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)用這一基因敲除文庫處理的一些細胞形成了高轉移性腫瘤，篩查出一些與腫瘤進化和轉移相關的基因，該方法將為在其他細胞類型和疾病中從事類似的研究鋪平道路。因此，對于那些我們不了解發(fā)生機制或信號轉導機制的疾病，我們可以通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行高通量基因敲除篩選，探究影響疾病發(fā)生的關鍵部件及可能的發(fā)生機制，發(fā)現(xiàn)新的具有潛力的藥物靶點。

技術原理

預測靶標基因并設計gRNA序列后利用芯片合成方法合成gRNA序列。構建gRNA文庫，利用 慢病毒 載體將所有gRNA轉入目的細胞中（低的MOI值）。通過相應處理（如加藥處理），利用高通量測序技術檢測處理前后細胞中gRNA豐度變化，推斷基因功能與細胞表型之間的對應關系。

解決方案

合生基因可根據(jù)客戶需求構建shRNA文庫和gRNA文庫，包括特定細胞的全基因組基因沉默、基因敲除、基因轉錄激活和轉錄抑制文庫；同時提供利用shRNA文庫或gRNA文庫進行高通量基因編輯，以及利用高通量基因編輯技術進行與疾病相關的藥物靶基因篩查服務。合生基因擁有一支具有豐富經(jīng)驗的CRISPR基因編輯經(jīng)驗的技術團隊，可以為客戶提供全方位的基因功能研究解決方案。