重組羧肽酶B酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書

（96T）           

1.試劑盒用途

該試劑盒用于體外定量檢測大腸菌液體中重組羧肽酶B含量。本試劑盒僅供研究或工業(yè)生產(chǎn)使用。

2.試劑盒基本參數(shù)

靈敏度 = 1 ng/ml

檢測范圍：0.25 - 64 ng/ml

特異性：可檢測重組羧肽酶B，與其它重組大腸菌表達系統(tǒng)相關(guān)蛋白無明顯交叉反應(yīng)。

重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均 < 10%。

工作時間：熟練實驗人員可在2.5小時內(nèi)完成一次測定。

有效期：6個月

3.試劑盒組成及保存

未拆封的試劑盒可在2-8℃保存一周。

說明:

1、所有試劑瓶須旋緊瓶蓋以防止蒸發(fā)和微生物污染。

2、酶標(biāo)板-20℃可存放6個月，2-8℃存放勿超過一周。

4.試驗所需自備物品

1. 酶標(biāo)儀（濾光片波長450 nm和650nm）

2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭，加樣槽

3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4. 潔凈無紙屑的吸水紙或干布

5.待測樣品注意事項

1、樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于2-8℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或 -80℃（3個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融。

2、試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍，如果您的樣品中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后再測。

3、若使用化學(xué)裂解液制備的樣本或細胞提取液，由于引入某些化學(xué)物質(zhì)會導(dǎo)致ELISA測值出現(xiàn)偏差。

6.檢測前準(zhǔn)備工作

①請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒平衡至室溫，觀察溶液是否有結(jié)晶，如果有結(jié)晶按提示進行操作。提前15分鐘打開酶標(biāo)儀預(yù)熱。

②稀釋液配制

將濃縮標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 或 濃縮HRP-抗體稀釋液用雙蒸水稀釋（1：10）。

③洗滌液配制

將濃縮洗滌液-1 或 濃縮洗滌液-2用雙蒸水稀釋（1：25）。

提示：從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液溫度應(yīng)為室溫）。請當(dāng)日使用。

④標(biāo)準(zhǔn)品配制

將標(biāo)準(zhǔn)品于1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘后，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0 mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘后上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為32ng/ml）, 然后進行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：32、 16、 8、 4、 2、 1、0.5 、0ng/ml。標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白孔0 ng/mL。

提示：溶解和稀釋標(biāo)準(zhǔn)品過程中盡量避免產(chǎn)生氣泡。

倍比稀釋方法 

取7只EP管，每管加入500 μL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液，從32 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液的EP管中混勻配成16 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。

提示：最后一管直接作為空白孔，不再加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

⑤HRP-抗體工作液配制

實驗前請先將抗體管1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，以避免管壁及管蓋上殘留抗體。實驗前計算實驗所需用量（以100 μL /孔計算），實際配制時應(yīng)多配制100-200 μL工作液。使用前15分鐘，用HRP-抗體稀釋液將濃縮辣根過氧化物酶化抗體稀釋為工作濃度（抗體：稀釋液 = 1：125），當(dāng)日使用。

⑥顯色底物（TMB）工作液配制

計算實驗所需顯色底物用量（以100 μL /孔計算），實際配制時應(yīng)多配制100-200 μL顯色底物工作液。使用前15分鐘，用底物稀釋液將TMB顯色底物稀釋為工作濃度（底物：稀釋液 =1：20），避光保存，當(dāng)日使用。

提示：配制顯色底物（TMB）工作液要嚴格避免污染，如出現(xiàn)變藍的現(xiàn)象應(yīng)重新配制。

7.洗板方法

①自動洗板機：每孔加入洗滌液350-400 μL（根據(jù)加滿孔的標(biāo)準(zhǔn)進行調(diào)整），注入和吸出間隔60秒。

②手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干，每孔加入洗滌液350-400 μL（根據(jù)加滿孔的標(biāo)準(zhǔn)進行調(diào)整），浸泡2-3分鐘，甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙上拍干。

8.操作步驟

①將標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔（復(fù)孔），每孔100 μL。待測樣品加入到其他孔，每孔100 μL，若樣本濃度高于檢測范圍，需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后加樣。將酶標(biāo)板覆膜并置于37℃孵育60分鐘。

提示：加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動酶標(biāo)板混勻避免產(chǎn)生氣泡。加樣時間控制在10分鐘內(nèi)。

②洗滌：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干。每孔加入350-400 μL（根據(jù)加滿孔的標(biāo)準(zhǔn)進行調(diào)整）洗滌液-1，浸泡2-3分鐘，甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。

③每孔加入HRP-抗體工作液100 μL，輕輕晃動酶標(biāo)板混勻避免產(chǎn)生氣泡，將酶標(biāo)板覆膜并置于37℃孵育30分鐘。    

④洗滌：用洗滌液-1洗板3次，方法同步驟2。

⑤洗滌：用洗滌液-2洗板2次，方法同步驟2。

提示：酶標(biāo)板洗滌不完全可能會造成標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度差，或背景值高。應(yīng)注意加入洗滌液的體積，以加滿酶標(biāo)板的孔為標(biāo)準(zhǔn)進行調(diào)整，確保所有的孔浸泡在洗滌液中并浸泡2-3分鐘。

⑥顯色：每孔加顯色底物（TMB）工作液100 μL，酶標(biāo)板覆膜置于37℃ 孵育10分鐘。

提示: 加顯色底物推薦使用排槍和加樣槽，但應(yīng)嚴格避免底物污染，確保所使用的加樣槽潔凈或一次性使用，加液時移液槍的槍頭切不要接觸孔內(nèi)溶液以避免污染，影響實驗結(jié)果。可通過觀察加樣槽中底物是否變藍預(yù)判底物是否被污染。根據(jù)實際顯色情況酌情縮短或延長，顯色時間在5-30分鐘范圍內(nèi)。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止。

⑦終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，室溫放置1分鐘。推薦使用排槍和加樣槽。

提示: