雞滑液囊支原體探針法熒光定量PCR試劑盒Mycoplasma Synoviae(MS)的特點
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經過優(yōu)化,靈敏性高。
3. 提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高,不會跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應。
5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。
6. 本產品只能用于科研。
包裝規(guī)格及成份(具體信息詳見説明書,以説明書為準)
成份 | 編號 | 十孔盒包裝 |
探針法 qRT-PCR 緩沖液 | A | 500μL(黃蓋) |
探針法 qRT-PCR 酶混合液 | B | 100μL(紅蓋) |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | C | 1 mL(黃蓋) |
探針法 qRT-PCR引物混合液 | D | 100 μL(白蓋) |
qRT-PCR 探針 | E | 50 μL(棕色管) |
探針法 qRT-PCR陽性對照(1×10E8 拷貝/μL) | F | 50 μL(黃蓋) |
使用手冊 | G | 一份 |
雞滑液囊支原體探針法熒光定量PCR試劑盒Mycoplasma Synoviae(MS)使用方法
一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,
千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,
只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備
7. 如果有N個樣品,最好設置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用10μL陽性對照的10000倍稀釋
液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的RNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。也以選購本公司的柱式病毒RNAout。本試劑盒免費贈送20次免RNA提取
的核酸釋放劑試用裝,該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR模板,省略了RNA提取步驟。
三、Probe qRT-PCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行)
9. 如果做定量分析并且只做1次重復,則標記N+9個PCR 管,其中N+2個用于上步得到的 N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),6個用于標準曲線。
如果做定性分析,并且只做1次重復,則標記N+4 個PCR管,
其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),
1個用于PCR陽性對照(用第4號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存
好后最后加):
成分 | 樣品管N+2個 | RT-PCR陰性對照管 | 標準曲線樣品管 (2-7 管) |
探針法qPCR緩沖液 | 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
探針法 qPCR 酶混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
qRT-PCR探針 | 各 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
探針qRT-PCR 引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
待測樣品 RNA 模板 | 各 5 μL | -- | -- |
超純水 | -- | 5 μL | -- |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液(2-7 號) | -- | -- | 各5 μL(2號樣到2號管,3號樣到3 號管…) |
蓋上蓋子后上機,按下面參數(shù)進行 qRT-PCR:
過程 | 溫度 | 時間 |
逆轉錄 | 50℃ | 30 min |
預變性 | 94℃ | 10 min |
qRT-PCR 反應(40 個循環(huán)) | 94℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min(采集 FAM 通道的熒光信號)
|
四、數(shù)據處理
11.如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品核酸濃度的log值,再推算出其濃度。
12.如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct值應該小于或等于39。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于39則為陽性。如果在39-40之間,則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。
雞滑液囊支原體探針法熒光定量PCR試劑盒Mycoplasma Synoviae(MS)【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存
有效期 12 個月。
雞滑液囊支原體探針法熒光定量PCR試劑盒Mycoplasma Synoviae(MS)注意事項
1操作嚴格按照說明書進行;
2試劑盒內各種組分使用前應自然融化,完全混勻并短暫離心;
3反應液應避光保存;
4反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
5使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;
6樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;
7實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
8試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
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