來源:Canavalia ensiformis

酶活:1U/mg

低溫運輸,-20℃保存

脲酶 (尿素酶 巨豆)(Urease(Jack Bean))

1. DNA帶模糊

1) DNA降解:避免核酸酶污染;

2) 電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液多次使用后,離子強度降低,pH值上升,緩沖能力減弱,從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液;

3) 所用電泳條件不合適:電泳時電壓不應(yīng)超過20V/cm,溫度<30℃;巨大DNA鏈電泳,溫度應(yīng)<15℃;核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力;

4) DNA上樣量過多:減少凝膠中DNA上樣量;

5) DNA樣含鹽過高:電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽;

6) 脲酶 (尿素酶 巨豆)(Urease(Jack Bean))有蛋白污染:電泳前酚抽提去除蛋白;

7) DNA變性:電泳前勿加熱,用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。

2. 不規(guī)則DNA帶遷移

1) 對于λ/Hind III片段cos位點復(fù)性電泳前于65℃加熱DNA 5分鐘,然后在冰上冷卻5分鐘;

2) 電泳條件不合適:電泳電壓不超過20V/cm;溫度<30℃;經(jīng)常更換電泳緩沖液;

3) DNA變性:以20 mM NaCl Buffer稀釋DNA,電泳前勿加熱。

3. 帶弱或無DNA帶

1) DNA的上樣量不夠:脲酶 (尿素酶 巨豆)(Urease(Jack Bean))增加DNA的上樣量;聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高,上樣量可適當(dāng)降低;

2) DNA降解:避免DNA的核酸酶污染;

3) DNA走出凝膠:縮短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度;

4) 對于EB染色的DNA,所用光源不合適:應(yīng)用短波長(254nm)的紫外光源。

4. DNA帶缺失

1) 小DNA帶走出凝膠:縮短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度;

2) 分子大小相近的DNA帶不易分辨:增加電泳時間,核準(zhǔn)正確的凝膠濃度;

3) DNA 變性:電泳前請勿高溫加熱DNA鏈,以20 mMNaCl Buffer稀釋DNA;

4) DNA鏈巨大,常規(guī)凝膠電泳不合適:在脈沖凝膠電泳上分析。

5. DNA電泳的Marker怎么是扭曲的?

1)脲酶 (尿素酶 巨豆)(Urease(Jack Bean))配制膠時的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時配制的。*是同時配制.電泳時緩沖液高過液面1-2mm即可。

2)電泳時電壓過高,可以在電泳前15分鐘用較低電壓(3V/cm),等條帶出孔后比較整齊了,再調(diào)高電壓。

3)上樣時盡量慢慢加樣,等樣品自然沉降后再加電壓。

6. 做PCR電泳后跑電泳,目的基因是490 bp,結(jié)果每次切膠回收后再重新電泳條帶就變成接近600 bp了?為什么?

有時只靠電泳結(jié)果判斷是不準(zhǔn)確的,同樣的片段每次跑的遠(yuǎn)近會有不同。有經(jīng)驗顯示目的片段是1300 bp,結(jié)果就跑到1000 bp的Marker下面去了,后來證實片段沒有問題。也有做的一個片段也是這樣,是490 bp理論上兩個條帶一樣,可是PCR結(jié)果顯示就是大小不一致。然后回收以后的檢測結(jié)果又全部都一樣了,后來又拿去做了下一個測序,才知道根本沒有問題。具體問題,具體分析。