中文名：NAD/NADH 定量試劑盒

英文名：NAD/NADH Quantitation Kit

英文別名：NAD/NADH Assay Kit

純度：足以進(jìn)行100次比色測試

貨號：N486176

包裝：1kit

存儲溫度：-20°C儲存

產(chǎn)品介紹：

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)是所有細(xì)胞中都存在的一種輔酶，包括NAD+(氧化型)和NADH(還原型)兩種形式。NAD+既是氧化還原反應(yīng)過程中傳遞電子的輔酶，又可以作為很多酶的底物來參與細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。NAD+在細(xì)胞和體內(nèi)發(fā)揮著重要的功能，其合成和降解及其產(chǎn)物參與細(xì)胞凋亡、代謝調(diào)控和基因表達(dá)的調(diào)控等，并且NAD+的減少是細(xì)胞死亡的主要因素之一。NAD+在調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)方面的重要性以及調(diào)控信號通路及轉(zhuǎn)錄方面的功能，使得NAD+及其合成和消耗的酶成為多種疾病的潛在藥物靶點(diǎn)。傳統(tǒng)的NAD+/NADH和NADP+/NADPH測定是通過檢測340 nm處的吸收來完成的，該方法靈敏度低且易受干擾。NAD/NADH檢測試劑盒是一種基于WST-8的顯色反應(yīng)，通過比色法來檢測細(xì)胞、組織或其它樣品中NAD+(氧化型輔酶Ⅰ)和NADH(還原型輔酶Ⅰ)各自的量、比值和總量的檢測試劑盒。NAD/NADH檢測試劑盒能特異性地檢測NAD+和NADH，而不檢測NADP+和NADPH，在反應(yīng)過程中NAD+被還原為NADH，NADH將WST-8還原成橙黃色formazan（甲臜），在450 nm左右有最大吸收峰。反應(yīng)體系中生成的formazan與樣品中NAD+或NADH的總量呈比例關(guān)系。本試劑盒可檢測0.1 μM-10 μM NAD+或NADH。

組分：

A. NAD+/NADH提取液；B. 乙醇脫氫酶；C. 顯色液；D. NADH；E. 10× NADH配制液；F. 反應(yīng)緩沖液；??

注意事項(xiàng)：

1. 建議NADH標(biāo)準(zhǔn)品溶解后小量分裝保存，避免反復(fù)凍融；

2. NAD+/NADH提取液粘稠，使用過程中務(wù)必保證和待加入的體系充分混勻；

3. 加樣和混勻過程中，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡影響最終的吸光度檢測；

4. 由于NAD+/NADH不穩(wěn)定，易降解，所以盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測；

5. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法:
1. 樣品準(zhǔn)備
細(xì)胞樣品（貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞）：收集約 1×106 個(gè)細(xì)胞，離心去除培養(yǎng)液，用預(yù)冷的 PBS 清洗細(xì)胞，離心 5 min，棄上清，加入 200 μL 冰浴預(yù)冷的 NAD+/NADH 提取液，輕輕吹打以促進(jìn)細(xì)胞的裂解，裂解過程在室溫或冰上操作均可。裂解結(jié)束后 12,000 g，4oC 離心 5-10 min，取上清備用。組織樣品：冰上預(yù)冷的 PBS 清洗組織后，稱取樣品 10-30 mg，用剪刀剪碎，置于勻漿器中，加入 400 μL NAD+/NADH 提取液于室溫下或冰上進(jìn)行勻漿，結(jié)束后 12,000 g，4℃離心 5-10 min，取上清備用。
2. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
（1）配制 10 mM NADH 標(biāo)品：10×NADH 配制液先用水稀釋為 1×的 NADH 配制液，再吸取 141.0 μL（20T）/704.8 μL（100T）1× NADH 配制液加入 D 組分所在的管中，充分溶解，得到 10 mM NADH 標(biāo)品溶液，適當(dāng)分裝后置于-80℃冰箱，避光保存。
（2）稀釋標(biāo)品：將 10 mM 的 NADH 標(biāo)品用 NADH 配制液稀釋成合適的濃度梯度，如 0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10 μM，向 96 孔板中每孔加入 20 μL 的標(biāo)準(zhǔn)品。如有需要，可根據(jù)樣品中 NADH 的含量適當(dāng)調(diào)整標(biāo)品濃度范圍。
（3）乙醇脫氫酶工作液的配制（現(xiàn)用現(xiàn)配）：用反應(yīng)緩沖液將乙醇脫氫酶稀釋 45 倍。檢測時(shí)，向每個(gè)標(biāo)品或樣品中加入 90 μL 乙醇脫氫酶工作液。
3. 樣品測定
（1）NAD+/NADH 總量測定：吸取 20 μL 待測樣品于 96 孔板中，設(shè)置重復(fù)。如樣品中的 NAD+或 NADH 含量過高，超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，則需用 NADH 配制液適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測，含量過低時(shí)應(yīng)增加樣品的用量。
（2）樣品中 NAD+、NADH 含量或 NAD+/NADH 比值的測定：向離心管中加入 50-100 μL 待測樣品，60℃加熱 30 min 以分解 NAD+，如果加熱后產(chǎn)生不溶物，10000 g，室溫或 4℃離心 5 min，吸取 20 μL 上清至 96 孔板中待測，設(shè)置重復(fù)。如樣品中的 NAD+或 NADH 含量過高，超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，則需用 NADH 配制液適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測，含量過低時(shí)應(yīng)增加樣品的用量。
（3）在 96 孔板中按照如下方式加樣：

（4）每孔加入 10 μL 顯色液，充分混勻后，室溫孵育 30 min，測 450 nm 處的吸光度。
（5）數(shù)據(jù)分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的 NAD+和 NADH 總濃度或 NADH 的濃度，通過樣品加入的體積即可計(jì)算出 NAD+、NADH、NAD+/NADH 總量。?

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