中文名：快速內切酶NcoI

英文名：LightNing? NcoI

貨號：L397482

包裝：1kit

存儲溫度：-20°C儲存

產(chǎn)品介紹：

產(chǎn)品組成

產(chǎn)品簡介

LightNing? 快速內切酶是一系列經(jīng)過基因工程重組、能夠在 5~15 分鐘內精確完成 DNA 切割的限制性內切酶，適用于質粒 DNA、 PCR 產(chǎn)物或基因組 DNA 等的快速酶切。LightNing? 快速內切酶具有如下特點：5~15 分鐘內即可完成酶切；共用一種酶切 Buffer，大大簡化酶切反應體系；良好的酶活冗余度，輕松應對底物過量或困難模板酶切。此外，去磷酸化、連接試劑在 CutOne? 酶切 Buffer 中具有 100% 活性，支持一管化反應，提升“酶切 - 修飾 - 連接” 的體驗。

建議的反應條件

1× CutOne? 緩沖液；

37℃溫育；

參照“DNA 快速酶切流程”配制反應體系。

失活條件

80℃溫育 20 min。

質量控制

功能活性檢測：最適反應溫度下，在 20 μl 反應體系中，1 μl LightNing? NcoI 能夠在 15 min 內完全消化 1 μg λDNA。

超長時間溫育檢測：最適反應溫度下，將 1 μl LightNing? NcoI 與 1 μg λDNA 共溫育 3 h，未檢測到其他核酸酶污染或星號活性引起的底物非特異性降解，延時酶切可能出現(xiàn)星號活性。

酶切 - 連接 - 再酶切檢測：最適反應溫度下，使用 1 μl LightNing? NcoI 消化底物，回收酶切產(chǎn)物。在 22℃下使用適量 Fast T4 DNA Ligase 可以將酶切產(chǎn)物重新連接。將連接產(chǎn)物再次回收后，使用相同的內切酶可以重新切開連接產(chǎn)物。

非特異性內切酶活性檢測：使最適反應溫度下，將 1 μl LightNing? NcoI 與 1 μg 超螺旋質粒 DNA 共同溫育 4 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，質粒 DNA 仍然處于超螺旋狀態(tài)。 藍白斑檢測：將含有單一 lacZα 基因的載體以 1 μl LightNing? NcoI 消化，重新連接后轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布在含有對應抗生素、IPTG 和 X-gal 的 LB 培養(yǎng)基平板上。連接正確的產(chǎn)物會生長出藍色菌落， 而連接錯誤（即 DNA 末端切口不完整）的產(chǎn)物將得到白色菌落。對 于 LightNing? 系列限制酶而言，白色菌落比例應小于 1%。

使用方法

1. DNA 快速酶切流程

① 在冰上按如下建議的加樣順序配制反應體系：

a. 本體系適用于經(jīng)過純化的 PCR 產(chǎn)物酶切。未純化的 PCR 產(chǎn)物具備一定的離子強度，10× CutOne? Buffer 加入量可適當減少至 2 μl。但由于 DNA 聚合酶同時具有外切酶活性，會影響酶切產(chǎn)物，因此如下一步需進行克隆等操作，建議酶切前對 PCR 產(chǎn)物進行純化。

② 輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時離心以收集掛壁液滴；

③ 37℃溫育 15 min（質粒），或 15~30 min（PCR 產(chǎn)物），或 30~60 min（基因組 DNA）；

④ 80℃溫育 20 min 即可使酶失活，停止反應（可選）。

2. 雙酶切或多酶切

① 每種快速內切酶的用量為 1 μl，并根據(jù)需要適當擴大反應體系；

② 所有快速內切酶的體積總和不得超過總反應體系的 1/10；

③ 如果所用的幾種快速內切酶的最適反應溫度不同，應先以最適溫度低的酶開始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應溫度下進行酶切反應。

3. 適用于質粒的擴大反應體系

注：如果總反應體系大于 20 μl，應適當增加溫育時間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。

不同 DNA 中的酶切位點數(shù)量

甲基化修飾影響

在不同反應緩沖液中的活性

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