顯色基質(zhì)鱟試劑盒使用說明書(終點(diǎn)顯色法，含偶氮化試劑)

貨號：SK0020

規(guī)格：100ml

保存：陰涼處，2-8℃，避光貯存。

產(chǎn)品內(nèi)容：

細(xì)菌內(nèi)毒素工作品，5支

鱟試劑， 1.7ml/支，5支

顯色基質(zhì)，1.7ml/支，5支

偶氮化試劑1，10ml/支，5支

偶氮化試劑2，10ml/支，5支

偶氮化試劑3，10ml/支，5支

HCl (反應(yīng)終止劑)， 50ml/瓶，1瓶

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，50ml/瓶，3瓶

用途：

顯色基質(zhì)鱟試劑( Chromogenic End-point TachypleusAmebocyte Lysate，CE TAL )用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測，禁止以任何途徑進(jìn)入機(jī)體。

原理：

鱟試劑為鱟科動物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品，鱟試劑中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下（溫度，pH值及無干擾物質(zhì)），細(xì)菌內(nèi)毒素激活C 因子，引起一系列酶促反應(yīng)，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì)，使其分解為多肽和黃色的對硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm） 。在一定時間內(nèi)，pNA的生成量與細(xì)菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，據(jù)此，可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。

同時，對硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色（λmax = 545nm），避免了供試品本身的顏色對405nm處吸收峰的干擾。

檢測限：

按反應(yīng)時間不同可檢測0.1EU/ml-1 EU/ml 和0.01EU/ml -0.1EU/ml 兩個區(qū)間( 反應(yīng)時間T 1 和T2 見出廠檢驗(yàn)報(bào)告)。

用法：

1. 材料和設(shè)備

1.1 試劑

鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作品、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑1 、偶氮化試劑2 、偶氮化試劑3、HCl (反應(yīng)終止劑) 、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。

1.2 器材

無熱原試管、無熱原吸頭、旋渦混合儀、移液器、多道移液器、封口膜、試管架、恒溫水浴箱（37±1℃）、分光光度計(jì)。

注意：接觸試劑及供試品的所有器皿必須是無熱原的(我公司提供無熱原耗材)。

玻璃器皿可經(jīng)250℃干烤至少60 分鐘去除熱原。

2. 供試品的貯存與預(yù)處理

備注：若供試品為血液類，請參照我廠配套血液相關(guān)處理試劑使用說明書。

2.1 供試品的pH 值應(yīng)在6 - 8 之間，若超出此范圍，需用無熱原緩沖液、0.1N 氫氧化鈉或0.1N 鹽酸調(diào)節(jié)。

2.2 若供試品中可能存在鱟實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì)，處理參見【供試品的干擾試驗(yàn)】。

2.3 若供試品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖會產(chǎn)生G 因子旁路反應(yīng)，干擾內(nèi)毒素檢測），需選用特異性鱟試劑（我公司提供）。

2.4 若供試品為一些抗菌素如頭孢類抗菌素和磺胺制劑會對偶氮染色劑產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng)而干擾偶氮化顯色，需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒（我公司提供）。

2.5 若供試品的本底吸光度值大于0.5，必須對供試品進(jìn)行稀釋后再檢測。

2.6 若供試品顏色較深(例如溶血)，或在酸性條件下顏色加深(例如一些組織培養(yǎng)介質(zhì))，必須設(shè)置供試品空白管以扣除供試品自身的顏色本底。供試品空白管不加入鱟試劑，以等體積鱟試劑的溶劑(該處為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水)代替。其余操作同供試品管。

3. 實(shí)驗(yàn)操作

3.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)曲線所采用的內(nèi)毒素濃度可以為0.01， 0.025， 0.05， 0.1 EU/ml 或0.1， 0.25， 0.5， 1.0EU/ml。稀釋方法如下（以0.1， 0.25， 0.5， 1.0 EU/ml 為例）：取細(xì)菌內(nèi)毒素工作品1 支，按細(xì)菌內(nèi)毒素工作品使用說明書稀釋為10EU/ml 的內(nèi)毒素溶液，再稀釋為1.0EU/ml 的內(nèi)毒素溶液，以1.0EU/ml 的內(nèi)毒素溶液為母液按下表稀釋成0.1，0.25，0.5， 1.0 EU/ml 的濃度梯度。配制好的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在4 小時內(nèi)用完。

表1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

3.2 陰性對照為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。

鱟試劑：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中，輕輕振搖使鱟試劑完全溶解，注意不要用旋渦混勻儀激烈振搖。溶解的鱟試劑應(yīng)在10 分鐘內(nèi)用完。

顯色基質(zhì)：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于顯色基質(zhì)中，輕輕振搖使顯色基質(zhì)完全溶解。顯色基質(zhì)溶液可在無污染的條件下于4 oC 貯存8 小時以內(nèi)。

偶氮化試劑1：按標(biāo)示量加反應(yīng)終止劑鹽酸于偶氮化試劑1 中，

偶氮化試劑2：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑2 中，

偶氮化試劑3：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑3 中，偶氮化試劑溶液可于4oC貯存1 周。