小鼠口腔粘膜成纖維細胞

原代細胞傳代方法：

一、貼壁細胞的消化法傳代

1、吸除或倒掉瓶內舊培養(yǎng)液。

2、加入1ml左右消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使瓶底細胞都浸入溶液中。

3、消化2-5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時，棄去消化液，加入培養(yǎng)液終止消化。

4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。

二、懸浮細胞的傳代

1、直接傳代

1）讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清吸掉1/2-2/3。

2）用吸管吹打形成細胞懸液后，分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2、離心法傳代

1）將細胞連同培養(yǎng)液一并轉移到離心管內，離心800-1000rpm，5分鐘。

2）去除上清，加新的培養(yǎng)液一離心管內，用吸管吹打使之形成細胞懸液。

3）將細胞懸液分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

原代細胞培養(yǎng)中的6個常見錯誤

錯誤＃1：一小管原代細胞在水浴中解凍一段時間

糾正＃1：原代細胞對解凍過程非常敏感，因此將小瓶置于37℃水浴中，保持并輕輕旋轉直到內容物剛剛解凍是很重要的。然后應立即從水浴中取出小瓶，并轉移到無菌操作臺。確保您的培養(yǎng)瓶在解凍前已經(jīng)準備就緒，以便可以立即用于接種細胞，并置于培養(yǎng)箱中。

錯誤＃2：解凍小瓶后直接離心原代細胞

糾正＃2：我們不建議在解凍后離心細胞，因為離心程序比少量的DMSO殘留更有害。記住，在恢復原代細胞后的第二天更換培養(yǎng)基以去除任何殘留的DMSO。

錯誤＃3：允許原代細胞變得過于融合

糾正＃3：當生長至100％匯合時，原代細胞可以變得衰老。記住，原代細胞不是100％純，因此重要的是盡量減少污染細胞的生長。我們建議在細胞達到90-95％融合時，對原代細胞進行傳代培養(yǎng)。

錯誤＃4：傳代原代細胞時過度胰蛋白酶消化

糾正＃4：當細胞傳代時，使用低濃度的胰蛋白酶并在顯微鏡下密切監(jiān)測細胞。此外，記得在胰蛋白酶消化后完全中和細胞中的胰酶，因為任何活性的胰蛋白酶都將損傷細胞。我們特別推薦專門為原代細胞配制的胰蛋白酶中和溶液，但也可以使用10％血清或大豆胰蛋白酶抑制劑。

錯誤＃5：原代細胞可以很容易地重新凍存

糾正＃5：通常我們不推薦重新凍存原代細胞，因為這可以促進細胞衰老和/或導致功能變化。原代細胞非常敏感，重新凍結可能導致細胞死亡或損傷。

錯誤6：原代細胞可以無限的增殖

糾正＃6：與細胞系不同，原代細胞具有有限的擴增能力。我們建議盡早使用原代細胞進行實驗以防止遺傳漂移。此外，如果你正在使用一個增值困難的細胞類型，你應該密切監(jiān)測細胞形態(tài)，因為少量混雜的細胞（如成纖維細胞）可能隨著時間的推移，大量生長從而成為主要細胞。

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