Cy5-dCTP溶液特點:

1.離心柱法;

2.快速:30min內(nèi)即可完成全部操作;

3.得率高:無需裂解紅細胞,直接從全血中提取DNA,可從0.2 mL健康人類全血中提取得到不低于3μg DNA;

4.操作簡便:無需水浴,全部提取操作可在室溫下進行;

5.高質(zhì)量:所提取的DNA純度高、得率高,可直接用于PCR、酶切、雜等下游實驗。

規(guī)格注意事項

1) 由于細胞凋亡是一個快速的過程,建議樣品在染色后1小時之內(nèi)進行分析。

2) 對于貼壁細胞,消化是一個關(guān)鍵步驟。貼壁細胞誘導(dǎo)細胞凋亡時如有漂浮細胞,需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。胰酶消化時間過短,細胞需要用力吹打才能脫落,容易造成細胞膜的損傷,PI攝入過多;消化時間過長,細胞膜同樣易造成損傷,甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后,輕搖時胰酶與細胞充分接觸,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余的少量胰酶再消化一段時間,待細胞間空隙增大,瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA,EDTA會影響Annexin V與PS的結(jié)合。

3) 實驗中如需要固定細胞,比如在檢測凋亡的同時檢測細胞周期,只能選用Annexin V-FITC,而不能選用Annexin V-EGFP,因為在固定過程中EGFP會變性導(dǎo)致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細胞與Annexin V-FITC進行孵育,并用binding buffer洗掉未結(jié)合的Annexin V-FITC。因為固定過程中細胞通透性增加會產(chǎn)生細胞碎片,可以和Annexin V結(jié)合,對結(jié)果產(chǎn)生干擾。

4) 如果樣品來源于血液,請務(wù)必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS,能與Annexin V結(jié)合,從而干擾實驗結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。

5) 試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底,避免開蓋時液體灑落。

6) Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì),在操作時請注意避光。

柱式DNA提取系列產(chǎn)品

2 柱式RNA提取系列(包括動物,血液,植物,細菌RNA提取)

3 5分鐘超快DNA電泳液

4 一步式質(zhì)粒DNA提取系列產(chǎn)品

5 “綠如藍”DNA染料

6 固相RNase清除劑

Cy5-dCTP溶液操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c.細胞懸液 離心收集細胞,每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol,反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2.將勻漿樣品在室溫(15-30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3.可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質(zhì),脂肪,多糖或胞外物質(zhì)(肌肉,植物部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中,如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。