CR擴增試劑盒試劑盒組份：

表 1：試劑盒組份

規(guī)格 ：100  反應

適用機型：

PRISM 7500 Real-Time PCR System (ABI)

StepOne Plus Real-Time PCR System (ABI)

LightCycler 480 (Roche)

AriaMX (Agilent Technologies)

CFX (BIO-RAD)

實驗所需但試劑盒未包含材料：

? 1.5ml 無菌低吸附離心管

? 96 孔 qPCR  板

? 一次性手套

? 1000ul 、100ul 、10ul 無菌低吸附帶濾芯移液槍頭

相關設備：

?  離心機

? 渦旋振蕩器

? 熒光定量 PCR 儀

? 1000ul 、100ul 、10ul 移液器

實驗操作過程：

一、 CHO DNA 定量參考品的稀釋及標準曲線的制備

用試劑盒中提供的 DNA dilution buffer 將 CHO control DNA 進行梯度稀釋， 稀釋濃度依 次為 300pg/ul 、30pg/ul 、3pg/ul 、300fg/ul 、30fg/ul 、3fg/ul 。具體操作如下：

1.將試劑盒中的 CHO control DNA 和 DNA dilution buffer 置于冰上融化，待完全融化后，

輕微振蕩混勻，簡短快速離心。

2.取 6 支干凈的 1.5ml 離心管，分別標記為 SD1 ，SD2 ，SD3 ，SD4 ，SD5, SD6。

3，SD1 管中加入 198ul DNA dilution buffer，其余管中分別加入 180ul DNA dilution buffer。

4,取 2ul  CHO  control  DNA 加入 SD1 管中，  然后渦旋振蕩混勻 5- 10s 后短時快速離心 5s，渦旋振蕩和快速離心各重復 3 次。

5,按表 2 依次進行 6 次梯度稀釋操作，稀釋操作同步驟 4。

表 2. CHO control DNA 的稀釋

二、加樣回收質控 ERC 的制備

根據待測樣本的殘留量設置 ERC 中 CHO  control  DNA 的加樣濃度  (以制備加 45pg  CHO control DNA 的樣本 ERC 為例)，操作如下：

1，取待測樣本 100u，加至 1.5ml 干凈的離心管中；

2，加入 1.5ul SD2，混勻，標記為樣本 ERC。

注：樣本 ERC 和同批待測樣本需一起進行樣本前處理。

三、陰性質控 NEG 的制備

根據實驗設置陰性質控，操作如下：

1，取 100ul 樣本基質溶液(或洗脫液)加至 1.5ml 干凈的離心管中標記為陰性質控 NEG。 注：陰性質控 NEG 樣本和同批待測樣本需一起進行樣本前處理。

四、 qPCR 反應液的制備和加樣

1，根據所要檢測的標準曲線及待測樣本數量，計算所需反應孔數，一般做 3 個重復孔/樣。

反應孔數=  (6 個濃度梯度+1 個無模板對照 NTC+1 個陰性質控 NEG+待測樣本×2) ×3 注：待測樣本×2 是為了讓每個待測樣本檢測時都同時做樣本 ERC 。                  2，根據反應孔數計算本次實驗所需的各組分的所需總量以制備 pre-mix：

2×Taqman master mix=(反應孔數+2) ×15ul    (含有 2 孔的損失量)

10×CHO qPCR mix=  (反應孔數+2) ×3ul

RNase-free H2O=  (反應孔數+2) ×2ul

3，各試劑置于冰上融化，振蕩混勻，按表 3 所示進行加樣：

表 3.各反應孔加樣示例

注：加樣完成后每孔總體積為 30ul。

表 4. 96 孔板排版示例

注：該表示例的是檢測 6 個濃度梯度的 CHO  control  DNA 標準曲線(SD1-SD6) 、1 個無模 板對照 NTC、1 個陰性質控 NEG、3 個待測樣本(S1-S3)和每個樣本的 ERC(S1 ERC-S3 ERC)。 每個檢測做 3 個重復孔。

4.  將 96 孔板用光學膜封閉，輕微振蕩混勻，短時間快速離心后放入 qPCR 儀中。

CR擴增試劑盒qPCR 程序參數設置(以 ABI 7500 為例)：

1.創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對定量檢測模塊。

2.創(chuàng)建新檢測探針，命名為 CHO-DNA，選擇報告熒光基團為 FAM，淬滅基團為 none,檢測 參比熒光為 ROX。

3.設置兩步法反應程序： 95oC 預變性 10min；95oC 10 sec，60oC 1min，40 個循環(huán)； 反應體積為 30ul。

qPCR 結果分析(以 ABI 7500 為例)

1.在 Results 的 Amplification  plot 面板中， 將 Threshold 設置為 0.05 ，點擊 Analyze，此時可 初步查看擴增曲線的形態(tài)是否正常。

2.在 Results  的 Plate 面板中，將標準曲線孔的 Task 一欄設置為 Standard，并且在 Quantity 一欄分別賦值為 3000 、300 、30 、3 、0.3 、0.03  (含義為每孔的 DNA 量， 單位為 pg)， 并且

在相應的 Sample Name 一欄命名為 SD1 、SD2 、SD3 、SD4 、SD5 、SD6。

3.在 Results 的 Plate 面板中，將無模板對照 NTC 孔的 Task 一欄設置為 NTC，將陰性質控 NEG 孔、待測樣本孔、樣本 ERC 孔的 Task 一欄設置為 Unknown，并且在相應的 Sample Name 一欄中命名為 NTC 、NEG 、S 、ERC ，之后點擊開始鍵。

4.在 Results 的 Standard Curve  面板中，可讀取標準曲線的斜率(Slope)、截距(Intercept)、R² 。

5.在 Results 的 Report 面板中， Mean Quantity 一欄可讀取無末班對照 NTC、陰性質控 NEG、 待測樣本、樣本 ERC 的檢測值。后續(xù)可在檢測報告中將單位換算為 pg/ml  樣本。

注:根據待測樣本和樣本 ERC 的檢測結果計算加樣回收率，加樣回收率要求在 50%- 150%之 間。