線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）試劑盒說明書

                              分光光度法50管/48樣

注    意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）試劑盒測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH，細菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細胞中，NAD-MDH分布于細胞質(zhì)和線粒體中。

測定原理：

MDHm催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體50mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體10mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體1mL×1支，-20℃保存；

試劑四、液體50 mL×1瓶，在4℃保存；

試劑五、粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑六、粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）試劑盒樣本測定的準備：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

① 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿液于600g，4℃離心5min。

③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④ 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的MDH（此步可選做）。

⑤ 在步驟④中的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體MDH測定。

測定步驟：

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將試劑四在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3、 操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻后立即在340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。

計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

MDHm活力單位的計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

MDHm（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =1299×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

MDHm（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=0.65×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，8×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；2000：細胞或細菌總數(shù)，2000萬。