乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)試劑盒說明書
分光光度法 50管/24樣
注 意:正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
LDH(EC 1.1.1.27)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是糖酵解途徑的末端酶,催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng),伴隨著NAD+/NADH之間互變。
乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)試劑盒測定原理:
LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸進(jìn)一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙,在堿性溶液中顯棕紅色,顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:30mL×1瓶, 4℃保存;
試劑一:液體15 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×1支,-20℃保存,用時加入10μL試劑五和1.3 mL蒸餾水充分溶解備用,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
試劑三:液體15 mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:液體50 mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:液體100μL×1支,4℃保存;
樣品測定的準(zhǔn)備:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為1000~5000:1的比例(建議2000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)試劑盒測定步驟:
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至450nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定(在EP管中加入下列試劑)
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 50 | 50 |
試劑一 | 250 | 250 |
試劑二 | 50 |
|
蒸餾水 |
| 50 |
充分混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴15min
充分混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴15min
充分混勻,室溫靜置15分鐘,450 nm下測定吸光度,計(jì)算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需要設(shè)一個對照管。
LDH活力單位的計(jì)算:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸曲線, y = 0.9108x+0.0037 (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,umol/mL;y為ΔA)。
2、血清(漿)LDH活力的計(jì)算
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0037)÷0.9108÷T×103=73.2×ΔA
3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中LDH活力的計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =73.2×ΔA÷Cpr
需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =73.2×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/104 cell)= [(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.037×ΔA
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.05mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,15 min;Cpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;2000:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),2000萬。
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為:0.1 umol/mL -2 umol/mL。
2、 ΔA線性范圍為:0.01 -2。
關(guān)鍵字: 乳酸脫氫酶(Lactate Dehydr;乳酸脫氫酶(Lactate Dehydr;
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