人絨毛膜滋養(yǎng)層原代細胞培養(yǎng)操作

取新生1天的SD大鼠，在無菌條件下用眼科剪剪除背部皮膚，剪去全部脊椎，將脊椎腹側朝下置于滅菌毛玻璃片上。在解剖顯微鏡下，沿椎管兩側水平剪除背側一半椎骨，暴露脊髓和神經(jīng)節(jié)。用微解剖鑷剝離脊髓后，從椎間孔中挑出背根神經(jīng)節(jié)，置于盛有預冷PBS液的滅菌玻璃平皿中，剝除神經(jīng)節(jié)被膜后，用1ml移液器將神經(jīng)節(jié)移入15ml離心管中，PBS離心漂洗2次。離心管中加入4ml 0.125%胰蛋白酶，吹打、混懸神經(jīng)節(jié)，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育20min，加入4ml DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，離心漂洗2次后，再加入2ml Neurobasal培養(yǎng)基(含4.5g/L D-葡萄糖，2mmol/L L-谷氨酰胺、1%FBS、20ml/L B-27添加劑、10ug/ml NGF、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml)。移液器反復吹打20-30次，使背根神經(jīng)節(jié)細胞盡可能分散，經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾，制成細胞懸液，接種于預先涂有PLL的細胞培養(yǎng)板中，接種密度為2-3x105/ml細胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中靜置培養(yǎng)，每周換液2次。

細胞動物及主要試劑

SD大鼠(新生1d)，購自武漢大學中南醫(yī)院動物實驗中心；

NGF購自PeproTech公司；

Neurobasal培養(yǎng)基、DMEM、胎牛血清(FBS)、B-27添加劑(50X)購自Gibeo公司；

L-谷氨酰胺、多聚賴氨酸(PLL)胰蛋白酶購自Sigma公司；

胰蛋白酶購自AMRESCO公司；

雙抗（青、鏈霉素）購自HyClone公司

人絨毛膜滋養(yǎng)層原代細胞傳代培養(yǎng)操作

1、 細胞貼壁生長，鋪滿瓶底80%左右或有細胞堆疊生長時即可傳代；

2、棄去原瓶培養(yǎng)液，用PBS清洗1~2次，加入3~4ml新鮮培養(yǎng)液，用細胞刮沿一個方向依次將瓶底細胞刮下，不要反復來回刮，對細胞損傷較大。刮完后可在鏡下觀察，若細胞團較多可用吸管輕輕吹散。也可直接用吸管吹打收集細胞，一般會有部分細胞吹不下來，可收集吹下來的部分細胞進行培養(yǎng)，切忌吹打過度。

3、將收集到的細胞按一定比例分裝到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，一般3~4h內(nèi)大部分細胞都會貼壁，若細胞碎片較多可在細胞貼壁后換液除去。

1. 確保所有實驗室材料都無菌

交叉污染是細胞培養(yǎng)的大敵。即使是最輕微的污染，也可能毀了幾個星期的成果。因培養(yǎng)箱內(nèi)溫暖潮濕，真菌極易生長，因此必須注意定期清潔。此外，在將 培養(yǎng)瓶、移液管及其他的相關物品放入超凈臺之前，應用酒精擦拭干凈，以避免污染。

2. 小心處理您的培養(yǎng)物

細胞培養(yǎng)的脆弱性怎么強調(diào)也不為過。 劇烈搖晃，或連續(xù)的溫度波動可能會對生長產(chǎn)生不利的影響。確保培養(yǎng)箱是水平的，溫度均一，且遠離電動儀器。此外， 盡量避免一次處理多個細胞系，因為它可能會影響細胞的基因型和表型。您還應定期完成STR圖譜分析，以確認細胞系的身份。

3. 在使用前正確解凍細胞

盡管解凍看起來是個簡單的步驟，但必須操作得當，以免傷害細胞。長時間暴露在高溫條件下會使細胞無法鋪板。因此，凍存管應當在37°C水浴中放置2分鐘，然后用條件培養(yǎng)基稀釋，以避免DMSO造成直接傷害。

4. 使用對數(shù)生長期的細胞

細胞培養(yǎng)過程共有3個階段：停滯期、 對數(shù)期和平臺期，分別代表了低細胞生長、高細胞生長和無細胞生長。最有活力的細胞是健康的，快速分裂的，在對數(shù)期以70-80%的匯合度存在。

5. 在傳代之前不要讓細胞完全匯合

匯合度是指貼壁細胞占據(jù)培養(yǎng)瓶表面積的比例。完全匯合意味著100%的表面都被貼壁細胞覆蓋。一定要避免這種狀態(tài)，因為它意味著細胞不能繼續(xù)生長。不過，當務之急是使用活躍生長的細胞。

6. 選擇的培養(yǎng)基開發(fā)策略

在細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基是控制產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)量和成本的最重要因素。必須針對每種培養(yǎng)物來定制培養(yǎng)基，以優(yōu)化實驗結果。在決定以哪種方式來開發(fā)您的培養(yǎng)基時，您有幾個選擇。您可以購買現(xiàn)成的，自己開發(fā)，也可以與另一家公司合作開發(fā)特定的培養(yǎng)基。在這個過程中，您需要考慮時間和成本等因素。

7. 配制干粉培養(yǎng)基時評估水的質(zhì)量

液體培養(yǎng)基往往會帶來比干粉培養(yǎng)基更高質(zhì)量的結果。這可能與水的質(zhì)量有關。由于細菌在水中迅速生長，故需要監(jiān)控內(nèi)毒素及其他污染物。專業(yè)公司有資源來控制細菌生長，比如過濾器。因此使用專業(yè)化生產(chǎn)的液體培養(yǎng)基會更加可靠一點。

8. 利用細胞的代謝特性來優(yōu)化培養(yǎng)基

分析使用過的培養(yǎng)基，有助于鑒定必要成分的代謝速率，包括氨基酸和維生素。從細胞生長階段和蛋白生產(chǎn)階段收集到的動態(tài)代謝圖譜可用來平衡基礎培養(yǎng)基和添加培養(yǎng)基，指導培養(yǎng)基的重點。

9. 避免細胞的過度消化

胰蛋白酶通過消化負責讓細胞與容器結合的蛋白質(zhì)，而實現(xiàn)貼壁細胞的傳代。如果細胞暴露在胰酶中時間太長，則胰酶將開始切割細胞表面蛋白，這會影響細胞行駛正常功能的能力。

10. 培養(yǎng)基中不要一直使用抗生素

隨著細胞培養(yǎng)物更加頻繁地暴露在抗生素中，對抗生素有著天然耐藥性的菌株將開始出現(xiàn)。這種現(xiàn)象可掩蓋潛在的污染，這對實驗是非常有害的。

人絨毛膜滋養(yǎng)層原代細胞注意事項

1、 培養(yǎng)過程中要盡量減少熱源的接觸，建議用一次性使用的瓶皿培養(yǎng)，一切與細胞接觸的器具要進行去熱源處理，建議使用進口血清；

2、傳代時吹打不宜過度，吹下來的細胞足夠傳代即可，不要反復吹打；

3、細胞生長速度很快，一般1~2天要傳一次代，密度達到80%左右即可傳代，可以適當降低接種密度，但密度較低時細胞會成堆生長，當出現(xiàn)細胞堆疊生長時也應當傳代；

4、若沒時間處理細胞，為避免細胞長過，可適當降低血清濃度（不低于5%）以減緩細胞生長速度，但不宜長期低血清培養(yǎng)，一般需正常培養(yǎng)1~2代以恢復其狀態(tài)。