人肺動脈成纖維原代細胞運輸和保存：干冰運輸及復蘇好存活細胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理：

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態(tài)，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。  收到細胞后次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基            81%      

優(yōu)質(zhì)胎牛血清                  15 %

GlutaMAX-1谷氨酰胺            1 %

MEM NEAA非必需氨基酸          1%

Sodium Pyruvate丙酮酸鈉       1%

P/S青霉素-鏈霉素              1%

β-巰基乙醇                 0.5ul（1000X)

LIF                        5ul（10ng/mL）

培養(yǎng)瓶用0.1%明膠包被，或者使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細胞。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：完全培養(yǎng)液 60%%，F(xiàn)BS 30%%，DMSO 10%%現(xiàn)用現(xiàn)配。

我?guī)靸龃鏁r，體積為 500 μl，預期存活率 70%，每支凍存管的細胞復蘇，3 至4 天后，會形成 30 至 40 個克隆，建議復蘇至 1 個 T25 培養(yǎng)瓶中。

二：細胞處理：

人肺動脈成纖維原代細胞鋪制：

1. 在 T25 培養(yǎng)瓶中加入 0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于 37℃細胞培養(yǎng)箱至少放置 15 min 以上。

2. 吸除 0.2%明膠，加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF 完全培養(yǎng)液。一般地，一個 T25 培養(yǎng)瓶中加入 5 ml MEF 完全培養(yǎng)液。

3.  按實驗需要：小鼠胚胎干細胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；復蘇 MEF 細胞若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

4. 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含 2 ml MEF 完全培養(yǎng)液的 15 ml 離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心 5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的 MEF 完全培養(yǎng)液 1 ml，重懸后按照一個 T25 培養(yǎng)瓶鋪 1′106 的 MEF 細胞，平均加入到 T25 培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻后置于 37℃細胞培養(yǎng)箱。24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細胞

5.復蘇或傳代小鼠胚胎干細胞前，將 T25 培養(yǎng)瓶中的 MEF 完全培養(yǎng)液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液待用。

復蘇：

1.將人肺動脈成纖維原代細胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

2. 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液的 15 ml 離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心 5 min。

3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液 2 ml，吹打懸浮。

4. 重復吹打，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡。

5.  轉(zhuǎn)移至 1 個已經(jīng)鋪好 MEF 細胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

6. 每天更換小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液。

傳代：

1. 一般在復蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定

2. 吸除廢液。

3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細胞。

5. 在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。

6.  加 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液終止消化。

7.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。

8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液，多次輕輕吹打細胞， 制成單細胞懸液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液，吹打混勻，細胞懸液分裝到鋪好 MEF 細胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地，一個 T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。傳代比例：1:4-1:7

凍存：

1.按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。

2.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預冷的凍存液，懸浮細胞。

3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標記細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。

4. 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。凍存液配方：

人肺動脈成纖維原代細胞完全培養(yǎng)液 60%，ES 級 FBS 30%，DMSO 10%

附：分離的簡易方法（差速貼壁法）：

1.培養(yǎng)中的人肺動脈成纖維原代細胞，按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)液重懸細胞， 吹打混勻，細胞懸液分裝到無 MEF 細胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地，一個T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞，在一個 10 cm 培養(yǎng)皿中進行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞）中。

2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時。

3.  1 小時后，絕大部分 MEF 細胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液，進行后續(xù)實驗。